淋巴细胞分离技术.ppt

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1、E花环试验ErythrocyteRosetteTest病原生物学实验室(免疫）任书荣一、实验目的掌握淋巴细胞分离技术，熟悉免疫细胞的检查及功能二、原理T细胞：CD2/SRBCR/E-受体总花环（Et)形成率：T细胞＋SRBC---4℃>2h或过夜E花环，代表总T细胞的百分率。60％－80％。活性E（Ea)花环T细胞＋SRBC短时间作用后涂片染色镜检E花环，代表T细胞的一个亚群。20％－－40％。三、试剂及器材(一)肝素(25u/ml)，淋巴细胞分层液(聚蔗糖—泛影葡胺)，Hank's液，1％SRBC，灭活小牛血清。(二)1ml吸管，注射器、针头、碘酒等。四、操作(一)1％SRBC悬液

2、制备取脱纤维绵羊血1—3ml，加等量Hank’s液，混匀后1500rpm离心5—8分钟，洗3次最后用Hank’s液配成1％悬液。(二)分离淋巴细胞在血球计数板记数淋巴细胞数，并将其配成1×107/ml浓度的淋巴细胞悬液。(三)花环形成试验1、取107淋巴细胞/ml悬液0.2ml，1％SRBC悬液0.2ml和小牛血清0.1毫升，在小试管中混合，置37℃孵育5分钟。2、取出后500rpm离心5分钟，放4℃冰箱20分钟。3、取出后轻轻摇动重新悬浮细胞，加半滴美兰液，用滴管吸细胞悬液一滴放载玻片上，加盖玻片后于高倍镜下计数。五、结果高倍镜下计数200个以上的淋巴细胞中TRFC的百分数。凡能

3、结合三个以上SRBC者为TRFC。TRFC（%）=TRFC×100％未形成花环淋巴细胞数＋TRFC六、注意事项(一)检测的血标本要新鲜，放置时间不要超过3—4小时。(二)试验用的SRBC要新鲜，脱纤维血4℃保存不得超过10天。(三)绵羊红细胞与淋巴细胞的比例以16∶1—50∶1为宜。(四)E花环计数前，应轻轻旋浮，不能用滴管用力吹打，否则会使形成的花环脱落。七、报告要求绘图记录并分析实验结果及意义。