t淋巴细胞分离技术

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1、T淋巴细胞分离技术–（一）原理　　混合单个核细胞悬液在通过尼龙毛柱时，B细胞、浆细胞、单核细胞和一些辅助细胞被选择性粘附于尼龙毛上，而多数T细胞则通过尼龙毛柱，这是获得富含T细胞群的有效方法。T淋巴细胞分离技术–（二）材料及试剂1．尼龙毛（NylonWoolFiber）。　　2．烧杯、铝箔、漏斗、一次性手套等。3．装填尼龙毛柱，一次性注射器。　　4．取自然沉降的上层血浆，过聚蔗糖—泛影葡胺分层液后，获取的血浆和分层液之间的单个核细胞层。T淋巴细胞分离技术–（三）操作方法　　1．尼龙毛的清洗与干燥　　（1

2、）戴上已经洗去滑石粉的一次性手套，将尼龙毛（1包或2包，每包35g）放入烧杯中，加入蒸馏水或去离子水，用铝箔盖上烧杯并煮沸约10min。　　（2）冷却至常温，倒入漏斗内，使水滴干。　　（3）重复（1）、（2）步骤6次。　　（4）将尼龙毛摊在铺有纱布的方盘内，37℃温箱干燥2～3天后，贮藏在带盖的方盘内。T淋巴细胞分离技术–2．装尼龙毛柱（1）取50ml玻璃注射器，拔去注射芯，在注射器头上套一段带夹子的胶管。　　（2）将尼龙毛梳理，并适当折叠，以适应注射器的直径，填入注射器内，约20ml的体积。（3）将填

3、好尼龙毛的注射器连同注射器芯一起包好，高压灭菌。　　3．细胞分离　　（1）将注射器固定在支架上，倒入37℃的细胞培养液，关闭阀门一定时间，然后打开阀门，放掉细胞培养液，以清洗几次尼龙毛，关上阀门。　　（2）将要分离的细胞液用预先加温的培养液稀释成适当的浓度，约5.00×107个细胞／ml。　　（3）将细胞液倒入注射器内，使之没过尼龙毛柱。盖上注射器，37℃温育45min　　至1h。　　（4）打开下口，缓慢放流（1滴／min），收集于离心管中。　　（5）离心，即获所需的T淋巴细胞。　　（6）关闭注射器下口

4、，于注射器内加入0.85％冰冷生理盐水，振荡，并套上注射器芯，打开下口，使劲推出注射器内液体，即获得粘附于尼龙毛上的B淋巴细胞、浆细胞、巨噬细胞等。T淋巴细胞分离技术–（四）注意事项1．此种分离法，T淋巴细胞也常有一部分被吸附，吸附的多少与尼龙毛的质量有关，与装柱的松紧也有关系。　　2．此法的T淋巴细胞的回收率约20％～30％。　　3．用过的尼龙毛可回收，以盐水洗涤，然后浸入0.1Mol/L的HCl中过夜，然后再同前法清洗.B细胞，T细胞分离方法——尼龙毛柱法1)尼龙毛柱的制备1．取直接3D，长度约10

5、cm的尼龙毛，用0.2mol/LHCl浸泡处理过夜。用双蒸水洗净HCl，置37℃烘干备用。2．称取50mg尼龙毛，均匀分散，置Hanks液中浸泡。取1ml注射器，出口接塑料管并夹住。将尼龙毛均匀填塞入注射器中，排净空气，柱高约5～6cm。此柱可分离约2×107细胞。将柱置－20℃可保存2～3个月。2)分离细胞1．取分离的单个核细胞，用细胞培养液将细胞配成2×107/0.5ml。2．融化尼龙毛柱，以每分钟5～7滴的速度放出Hanks液，并用5ml预温至37℃的细胞培养液洗涤尼龙毛柱。小心将细胞悬液加入尼龙

6、毛柱中，待细胞悬液全部进入尼龙毛柱后，立即加0.2ml细胞培养液，夹住塑料管。3．在37℃5％CO2的饱和水汽二氧化碳培养箱中静置1小时。用5ml预温至37℃的细胞培养液洗脱细胞。洗脱液中含有纯的T细胞。再用5ml预温至37℃的细胞培养液洗涤尼龙毛柱，洗净不粘附的细胞。4．加入0.5ml细胞培养液，夹住塑料管，将尼龙毛柱置冰箱中冷却。用4℃预冷的细胞培养液分3～4次洗脱尼龙毛柱，每次0.5ml。可先夹住塑料管，用玻璃棒或金属丝反复挤压尼龙毛以利粘附细胞脱落，然后再洗脱。洗脱液中含有大量B细胞。离心100

7、0×g10分钟，去上清液，用细胞培养液同样洗涤细胞1次。计数细胞，用细胞培养液将细胞配成适当浓度