淋巴细胞分离.doc

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1、淋巴细胞分离与计数淋巴细胞分离原理：外周血各种血细胞的密度不尽相同，利用淋巴细胞分层液（Ficoll）作密度梯度离心，使一定比重的细胞群按相应密度梯度分布，从而将各种血细胞加以分离。实验材料：淋巴细胞分离液肝素稀释液（生理盐水）RPMI1640粉末实验设备：1ml移液器、移液管、5ml注射器、刻度吸管、EP管、离心机、显微镜操作流程：1.在离心管中加入适量淋巴细胞分离液。2.无菌采集静脉血若干毫升,注入盛有肝素的无菌小瓶中，（每1ml全血加0.1ml125-250U/ml肝素溶液),加盖后立即轻轻摇匀,使血液抗凝3.稀释（外

2、周血：稀释液=1：2取肝素抗凝血与等量生理盐水充分混匀）4.用刻度吸管沿倾斜的管壁，把稀释血缓慢叠加于分层液面上，注意保持清楚的界面（Ficoll：稀释血=1：2）5.放入离心机1500r/min离心20min（注:缓慢加速1-4档个3分钟）6.用吸管插到云雾层，吸取单个核细胞。置入另一离心管中，加入5倍以上体积的稀释液（生理盐水），1500rpm×10分钟离心，洗涤细胞。7.重复洗涤一次，1500rpm×10分钟离心。8.末次离心后，弃上清，加入含有10％小牛血清的RPMI1640，重悬细胞9.计数细胞后再调整细胞置所需浓

3、度.10.取一滴细胞悬液与一滴0.2％台盼兰染液混合，于血球计数板上，计数四个大方格内的细胞总数。单个核细胞浓度(细胞数／1毫升细胞悬液)＝4个大方格内细胞总数　　──────────　×　10４×2(稀释倍数)411.分离出的淋巴细胞置于培养瓶中二氧化碳培养箱培养。注意事项:1.每毫升外周血液大约可获1×106单个核细胞2.Ficoll应适量，外周血应充分稀释3.温度直接影响到Ficoll的比重和分离效果4.在Ficoll上加入稀释外周血时，应缓慢加，以免冲散界面5.吸取单个核细胞层时，应避免吸出过多的上清液或分层液而导致

4、血小板污染淋巴细胞计数：实验流程：1.准备计数板：2.制备细胞悬液：收集细胞，制成单个细胞悬液3.加样：用吸管轻轻吹打细胞悬液，取少许细胞悬液，在计数板上盖玻片的一侧加微量细胞悬液，4.计数：在显微镜下，用10×物镜观察计数板四角大方格中的细胞数5.计算：将结果代入下式，得出细胞密度胞数/毫升原=（4大格细胞数之和/4）×104注意事项：1.取样计数前，应充分混匀细胞悬液2.加样量不要溢出盖玻片，也不要过少或带气泡3.细胞压中线时，数上不数下，数左不数右4.本法要求细胞密度不低于104细胞/ml5.镜下计数时，细胞数过少或过

5、多，说明稀释不当，需重新制备细胞悬液、计数