免疫细胞分离与免疫细胞功能检测及应用

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1、第十三章免疫细胞分离与免疫细胞功能检测及应用河南科技大学第一附属医院检验科许德英第十三章免疫细胞的分离与免疫细胞功能检测及应用第一节           免疫细胞的分离一、       外周血单个核细胞分离二、       淋巴细胞的分离三、T细胞和B细胞的分离四、T细胞亚群的分离第二节淋巴细胞标志及亚群分类一、 Ｔ细胞表面标志及亚群二、B细胞表面标志三、NK细胞表面标志第三节抗原提成细胞表面标志的检测一、单核-吞噬细胞系统二、树突状细胞第四节淋巴细胞的功能检测一、T细胞功能检测二、B细胞功能检测三、NK细胞活

2、性测定第五节其他免疫细胞功能检测技术一、中性粒细胞功能检测二、巨噬细胞功能检测第六节免疫细胞表面标志和功能检测的临床应用思考题小结第一节免疫细胞的分离外周血单个核细胞分离淋巴细胞的分离T细胞和B细胞的分离T细胞亚群的分离一、外周血单个核细胞分离外周血单个核细胞（peripheralmononuclearcells,PMNC）包括淋巴细胞和单核细胞（monocyte）。Ficoll分离液法主要用于分离外周血中的单个核细胞，是一种单次差速密度梯度离心的分离法。细胞分离基本原理不同细胞密度不同不同细胞表面生物学特性不

3、同不同细胞表面分化抗原不同不同细胞密度不同人的红细胞密度为1.093粒细胞密度为1.092单个核细胞（淋巴细胞和单核细胞）的密度为1.075-1.090不同细胞密度不同用1.077±0.001的分层液可将细胞分离分离液的基本要求对细胞无毒基本等渗不溶于血浆或分离物质有一定密度密度梯度离心法（densitygradientcentrifudation)Ficoll（商品名）成份：2份6%聚蔗糖（ficoll)水溶液+1份34%泛影葡胺（hypaque)生理盐水溶液。最常用的方法，分离纯度可达95%，细胞获取率80

4、%。试验尽量在低温下进行（4℃~8℃或冰浴）。密度梯度离心(Ficoll)离心密度梯度分离单个核细胞（Ficoll分层液）密度梯度分离单个核细胞（Ficoll分层液）二、淋巴细胞分离贴壁粘附法吸附柱过滤法磁铁吸引法Percoll分离液法（连续密度梯度离心）（去单核细胞）贴壁黏附法将已制备的单个核细胞悬液倾于玻璃或塑料平皿或扁平小瓶中，移至37℃温箱静置1h左右，单核细胞和粒细胞均贴于平皿壁上，而未贴壁的非粘附细胞几乎为纯淋巴细胞，继用橡皮刮下贴壁的细胞即为纯单核细胞群。因B细胞也有贴壁现象，用本法分离的淋巴细胞

5、群中B细胞有所损失。2.吸附柱过滤法将单个核细胞悬液注入装有玻璃纤维或葡聚糖凝胶SephadexG10的柱层中，凡有粘附能力的细胞绝大部分被吸附而粘滞在柱层中，从柱上洗脱下来的细胞主要是淋巴细胞。此法简单易行，对细胞极少损害。3.Percoll分层液法Percoll(商品名）经过聚乙烯吡咯烷酮（polyvinylpyrolidone,PVP)处理的硅胶颗粒大小不一的混悬液。高速离心后，形成连续密度梯度，可将密度不同的细胞分离纯化。分离淋巴细胞纯度达98%，单个核细胞纯度达78%。流程长、烦琐、费用高。密度梯度分

6、离单个核细胞（Percoll分层液）E花环沉降法尼龙毛柱分离法三、T细胞和B细胞的分离E花环分离法T细胞（CD2/LFA2/E受体）＋绵羊红细胞SRBCE花环比重增加Ficoll-Hypaque分离液分离低渗尼龙棉柱分离法尼龙棉装入5ml注射器中加入淋巴细胞悬液37℃、5％CO2、1－2hRPMI1640完全培养基灌洗洗脱液中为T细胞原理B细胞可粘附尼龙毛；T细胞不具有粘附活性。方法评价：实验室常用分离方法之一简便、易行获得细胞纯度较高T细胞90％B细胞80％尼龙毛柱法＋E花环法，T细胞可达99％以上四、T细胞

7、亚群的分离亲和板结合分离法磁性微球分离法荧光激活细胞分离仪分离法亲和板分离法利用亲和层析法分离淋巴细胞亚群，其原理是各种淋巴细胞亚群具有不同的抗原性，将相应抗体结合于塑料平板上，继加细胞悬液，凡抗原阳性的细胞则与相应抗体结合，抗原阴性的细胞可从未吸附的细胞悬液中获取。同样若用特异性抗原交联在塑料板上，则可分离得具有特异抗原受体的淋巴细胞。淋巴细胞受体与特异抗原或抗体接触，可引起细胞激活，因此，凡欲去除细胞悬液内某一细胞亚群时，本法更适用。如要分离CD4+或CD8+细胞，则可用抗CD4或CD8单克隆抗体吸附。用抗

8、Ig抗体则可分离B细胞。同样，用活化的C3包被，可分离出有C3受体的细胞。荧光激活细胞分离仪分离法（五）免疫磁珠法原理：将抗体交联于磁珠表面形成免疫磁珠（Immunomagneticbead，IMB）加入细胞悬液，IMB上的Ab与细胞表面的Ag反应，形成抗体/抗原的复合物。外加磁场，分选出结合有免疫细胞的IMB。直接法抗CD3磁球磁球结合T细胞加入B和T细胞中负向选择正向选择磁架进行分