苦参碱诱导人肝癌细胞株hpg2.2.15凋亡的实验研究

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1、苦参碱诱导人肝癌细胞株HpG2.2.15凋亡的实验研究【关键词】HpG2.2.15细胞株；苦参碱；凋亡；凋亡蛋白乙肝病毒与肝癌发生密切相关，两者相关率高达80％，在肝细胞癌中，血清HBV阳性感染率为94.78％；HBsAg阳性携带率为89.57％［1］。HBV-DNA与肝细胞DNA紧密结合在一起，乙肝病毒产生的X蛋白在肝癌的发生和发展中起着重要的作用。苦参碱可诱导人肝癌细胞株HpG2凋亡，应用全基因组表达谱芯片检测差异表达基因，苦参碱可改变人肝癌细胞株HpG2细胞基因谱，调控凋亡基因的表达，在苦参碱治疗的C6细胞株

2、中，57个基因表达上升2倍，而11个基因至少下调2倍［2，3］。苦参碱可诱导l∶50mg，江苏吴中医药集团有限公司，批号070604。MTT和G418购自sigma公司，胰蛋白酶和Fas抗体购于sigma公司。DAB试剂盒购自天津灏洋生物公司，ABC-Kit试剂盒购自sigma公司。兔抗人HBxAg多克隆抗体（HBx99rabbitpdycolonalABserum，Rabbit2）由本实验室保存。　　1.3仪器酶标仪（美国Bio-Rad公司680），BDFACSCanto流式细胞仪，电泳仪(美国Bio-Rad公司

3、)，紫外透射仪(美国Bio-Rad公司)。　　2方法分为治疗组、对照组和空白组。对照组采用顺铂。　　2.1MTT实验法①MTT用PBS配制成5mg/ml。②细胞悬液以104/孔接种于96孔培养板（200μl/孔），治疗组每孔加入苦参碱10μl（200μg/ml），对照组DDP10μl（20μg/ml），空白组加入培养液10μl/孔。③在37℃，5%CO2的培养箱中培养24h。④每孔加入MTT20μl，每次3孔，37℃作用4h。⑤吸弃各孔中的上清，每孔加入DMSO150μl，振荡，紫蓝色沉淀充分溶解，用酶标仪在波长5

4、40nm处测定吸光度A值。⑥上述试验重复4次。　　2.2流式细胞学检测法①对数生长期的细胞，胰酶消化后，以5×104/ml的密度接种，贴壁后加入DMEM培养基培养24h，治疗组加入苦参碱10μl（200μg/ml），对照组加入顺铂10μl（20μg/ml），空白组加入等体积的培养液。②继续培养48h，胰酶消化成单细胞悬液，冰PBS洗涤2次，800r/min离心5min，弃上清，缓慢加入-20℃预冷的70%乙醇，4℃过夜。③取细胞悬液，PBS洗涤，1600r/min离心5min后，弃上清。PI染液1.0ml染30mi

5、n，混合液经过300目滤网以除去杂质，620nm检测。每样本收集多于10000个荧光信号。④在流式细胞仪上作Fas基因表达分析。将细胞培养后直接将细胞送至流式细胞室做检查。　　2.3RT-PCR试验方法　　2.3.1引物序列Fas-F5'-TCCTACCTCTGGTTCTTAC-3'Fas-R5'-CTCTTCACTTCCTCTTTGC-3'Beta-actinF5'-ACTCTTCCAGCCTTCCTT-3'Beta-actinR5'-ACTCGTCATACTCCTGCT-3'　　2.3.2逆转录过程（RT）试剂

6、：5×AMVbufferRNA酶抑制剂随机引物DNTPsAMVRT反应体系20μl灭菌的DEPC水10.3μl5×AMVbuffer4μlRNA抑制剂0.4μlOligo(DT)1μldNITs1.3μlRAN2μlAMV1μl　　2.3.3反应条件37℃90min，95℃10min，4℃pause。PCR反应体系25μldH2O14μl10×PCRBuffer2.5μldNTPs1.2μlPrimer11.2μlPrimer21.2μlTemplate4μlTaq酶0.8μl　　2.3.4PCR反应程序95℃4m

7、in→95℃40s→54℃30s→72℃30s→72℃5min→4℃pause　　从图2中可看出，顺铂和苦参碱组的吸光度值随着时间的延长而减少，细胞数量逐渐减少，顺铂和苦参碱具有诱导人肝癌HpG2.2.15细胞株凋亡的作用。　　3.2细胞凋亡细胞凋亡的实验结果见图3。经χ2检验，χ2=8.00，P=0.000，按a=0.05水准，各组诱导细胞凋亡有差别。苦参碱诱导细胞凋亡率为57.9%。结果见图4。　　　3.3苦参碱对Fas蛋白的影响诱导Fas蛋白的表达。见图5。　　经χ2检验，χ2=1.41，P=0.000，按a

8、=0.05水准，在诱导Fas基因表达具有统计学意义。苦参碱诱导Fas基因的表达率（4.11%）要优于DDP（3.7%）。见图6。　　3.4苦参碱对Fas基因的影响Fas表达产物是495bp，HpG2.2.15细胞株Fas基因表达较弱，HpG2有明显Fas基因表达。苦参碱可以诱导HpG2.2.15细胞株的Fas基因表达，其作用要低于内毒素。结果见图7～8。