苦参碱诱导人肝癌细胞株hepg2分化 凋亡及g1期细胞周期调节因子的作用研究

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1、重庆医科大学博士学位论文苦参碱诱导人肝癌细胞株HepG2分化、凋亡及G1期细胞周期调节因子的作用姓名：司维柯申请学位级别：博士专业：临床检验诊断学指导教师：康格非2000.5.1—重垦垦型奎兰幽塞圭丝苎：!：英文缩写MAMatrine苦参碱MTT5-diphenylte缸azoliumbromide四甲基偶氮唑盐H’．TDRLitiatedthymidine氚化胸腺嘧啶核苷LDHLactateDehydrogenase乳酸脱氢酶CovAConcanavalinA伴刀豆球蛋白APCNAProliferatingcellnuclear

2、antigen增殖细胞核抗原AFPAlpha-fetoprotein甲胎蛋白PHAPhytohemagglutinin植物血凝素cGMPcyclicguanosinemonophosphate环磷酸鸟苷o蝴Cyclicadenosineinollophosphate环磷酸腺苷GGT卜glatamyltransferase卜谷氨酰转移酶HSGGTHepatomaspecialr-glutamyltransferase肝癌特异性r-谷氨酰转移酶w053Wildtypep53野生型p53基因mRNAMessengerRNA信使RNAIH

3、CImmunocytochemistry免疫细胞化学ISHHInsituhybridizationhistochemistry原位杂交组织化学PBSPhosphatebufferedsaline磷酸盐缓冲液DABDiaminobenzidine二氨基联苯胺液PIPropidiumiodide碘化丙啶PSPhosphatidyserine磷脂酰丝氨酸hHour小时cDNAComplementaryDNA互补DNAHEHemaloxylineosin苏木素伊红FCMFlowcytometry流式细胞术rap53Mutantp53突变型

4、p53DEPCDiethylpyrocarbonate焦碳酸二乙酯重庆医科大学博士研究生论文rpmRevolutionsperminute每分钟转速CyclinCyelin细胞周期蛋白CDKsCyclin-dependentkinases依赖细胞周期蛋白激酶CⅪsCyclin·dependentkinasesinhibitors依赖细胞周期蛋白激酶抑制剂重庆医科大学博士研究生论文苦参碱诱导人肝癌细胞株HepG2分化、凋亡及G1期细胞周期调节因子的作用摘要rl苦参碱是传统中药——苦参根提取物的纯化学成份之一，近几年的研窥进一步表明：

5、它在体外有抗肿瘤的作用，在临床也有苦参碱对自血病和肝癌治疗有效的报道。此外它的毒付作用小并能提高免疫力，故可能是较理想的抗癌药物。但目前苦参碱在体内外抗肿瘤的作用机理不明，特别是抗实体瘤的研究至今国内外罕见报道。肝癌在我国已上升为第二位癌症杀手，在城市仅次于肺癌，在农村仅次于胃癌，所以肝癌的防治研究很重要。故苦参碱抗肝癌及其机理的研究很有意义。本课题以苦参碱为诱导剂，以人肝癌细胞株HepG2为实验模型，研究其抑制HepG2增殖的机理，主要从四方面进行了研究：·1．苦参碱抑制HepG2细胞增殖的实验研究。采用MTT法、H3．TdR掺

6、入法、细胞计数法检测细胞存活率、DNA合成抑制率和细胞数量的变化。台盼蓝拒染法和细胞外液LDH活性测定观察细胞坏死。确定苦参碱可抑制HepG2增殖及诱导肝癌细胞分化、凋亡、坏死的作用浓度和时间。2．苦参碱诱导HepG2细胞分化的研究。(1)细胞水平研究：光镜、电镜观察细胞表面、形态和超微结构变化。ConA、PHA凝集反应观察细胞表面糖链组成改变。(2)代谢水平研究：放免法检测甲胎蛋白、cAMP、cGMP量的改变。亲和层析法分离肝癌GGT(HSGGT)，酶动力法检测HSGGT和GGT酶活性。(3)基因水平研究：免疫组化和原位杂交法检

7、测抑癌基因P53、Rb和癌基因N-ras、c—myc蛋白质和mRNA表达变化。重庆医科大学博士研究生论文3．苦参碱诱导HepG2细胞凋亡研究。光镜、电镜观察细胞凋亡形态。TUNEL法原位检测DNA断裂，流式细胞仪检测凋亡峰和AnnexinV．FITC／PI双标记检测细胞早期凋亡。免疫组化和原位杂交法检测Bcl．2、Bax基因和Fas蛋白表达。4．苦参碱抑制HepG2细胞增殖时G，细胞周期调节因子的变化。流式细胞仪检测细胞周期变化。免疫组化检测p53、Rb、p21、p16、p27、CyclinD，蛋白表达。所有免疫组化和原位杂交显色

8、结果均采用真彩色图像分析仪定量检测并用EXCEL软件统计处理。主要研究结果如下：1．苦参碱抑制HepG2细胞增殖的实验研究。苦参碱浓度小于0．39／L时不能抑制HepG2的增殖，细胞存活率大于80％；0．7．0．89／L时，HepG2对药物中度敏感