抗重组蛋白rvvc多克隆抗体的制备及其保护作用的鉴定

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1、抗重组蛋白rVVC多克隆抗体的制备及其保护作用的鉴定：姚蔚，周建娟，李桂军，谢旦立，楼永良堃【摘要】目的:纯化rVVC免疫家兔，制备并纯化多克隆抗体。观察复性rVVC、纯化多克隆抗体、rVVC和纯化多克隆抗体混合作用肝癌细胞SMMC7721后，肝癌细胞SMMC7721形态学和活性变化，评估抗重组rVVC蛋白多克隆抗体对肝癌细胞SMMC772的保护作用。方法:纯化重组蛋白rVVC免疫日本大耳兔获得多克隆抗体，多克隆抗体经过硫酸铵盐析、SephadexG25除盐和DEAE-SephadexG100层析纯化并进行MC7721后，显微镜观察并以MTT法确定抗重组rVVC蛋

2、白多克隆抗体对肝癌细胞SMMC7721的保护作用。结果:兔抗重组rVVC多克隆抗体经盐析法、分子筛和阴离子交换层析法纯化后，得到较纯的IgG分子。免疫印迹结果显示，抗重组rVVC蛋白多克隆抗体与纯化抗原呈现特异性反应条带。显微镜观察和MTT结果表明，纯化多克隆抗体能够阻断重组rVVC活性蛋白对肝癌细胞SMMC772的损伤。结论:成功制备了具有保护和阻断作用的兔抗重组rVVC多克隆抗体，为以后rVVC促炎症、促应激作用机制和信号传导机制研究提供一个重要的阻断剂。【关键词】创伤弧菌溶细胞素；多克隆抗体；保护作用；阻断作用Abstract:Objective:Topre

3、pareandpurifyrabbitpolyclonalantibodyagainstrVVC，toevaluatetheprotectionofpolyclonalantibodybyobservingthemorphologyandactivitychangesofSMMC7721cellsactedbypurifiedrVVC，purifiedpolyclonalantibody，themixtureofrVVCandpolyclonalantibody.Method:RabbitpolyclonalantibodyagainstrVVCpreparedb

4、yimmunningrabbitixtureofVVCandpolyclonalantibody，rabbitpolyclonalantibodyprotectionicroscopeandethod.Result:RabbitpolyclonalantibodyagainstrVVCethodsofPersulfate，SephadexG25andDEAE-SephadexG100.Polyclonalantibodyshomunoreactivity.TheresultsofMTTandmicroscopeobservatienindicatedthatpol

5、yclonalantibodycouldblockupthedamageofSMMC7721cellsactedbyrVVC.Conclusion:RabbitpolyclonalantibodyagainstrVVCechanismofinflammation，stressandsignaltransductionofrVVC.Keyg/ml，4℃条件下，取1ml样品加到Ni-NTA亲合层析柱中，流速控制在15ml/h左右，进行蛋白质挂柱。层析用10倍NTA体积的NTA-0Buffer洗脱，流速控制在30ml/h左右。再分别用3倍NTA体积的5.5、5.0、4.

6、5、4.0、3.5、3.0、2.5、2.0、1.5、1.0、0.5mol/L盐酸胍洗脱，流速控制在15ml/h左右。3倍NTA体积的NTA-1000Buffer洗脱，收集洗脱液并用PBS溶液透析24h，期间要求多次更换透析液。取透析好的蛋白溶液于4℃、12000r/min离心取上清液，以考马斯亮蓝进行蛋白质定量分析，滤过除菌，-70℃冻干保存。1.2.2重组蛋白rVVC溶血活性检测：将一定量复性重组rVVC蛋白加入1ml0.7%兔红细胞悬液中，再加PBS-BA缓冲液至2ml，37℃水浴20min，显微镜观察细胞形态学变化。2500r/min离心5min，取上清于5

7、45nm处测吸光度值，以使0.7%兔红细胞悬液中的血细胞溶血一半时所需的蛋白质的量定义为一个溶血单位来计算其溶血活性。1.2.3兔抗重组蛋白rVVC多克隆抗体的制备、提纯、MC7721细胞培养和活性检测：SMMC7721细胞用DMEM高糖培养基（含10%FBS、100IU/ml青霉素、100μg/ml链霉素）置于37℃、5%CO2培养箱中培养，待细胞密度达到80%～90%后，用0.25%胰蛋白酶消化10min，加DMEM培养液终止消化，收集细胞并用DMEM培养液吹打为单细胞悬液，调整细胞浓度为1×106/ml，加于96孔培养板，每孔100μl，置于37℃、5%CO

8、2条件下培