可溶性mica在乳腺癌免疫逃逸中的作用

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1、可溶性MICA在乳腺癌免疫逃逸中的作用：叶韵斌,周智锋,陈强,李洁羽,陈夏,黄伟炜【摘要】目的:观察乳腺癌患者血清中可溶性MICA（sMICA）表达情况,探讨sMICA在乳腺癌免疫逃逸中的作用。方法:ELISA方法检测乳腺肿瘤患者外周血sMICA的分泌。流式细胞术（FCM）检测sMICA及白细胞介素15（IL15）对NK细胞表面NKG2D表达的影响。MTT法检测NK细胞对乳腺癌细胞的杀伤活性。结果:ELISA结果显示,血清sMICA含量在健康成年人血清中为阴性,在乳腺良性肿瘤患者血清中含量为（76.8±22.3）ng/L,在恶性肿瘤患者血清中含量为（205.36±71.

2、27）ng/L,乳腺癌患者中血清sMICA含量高低与TNM分期呈正相关。应用含sMICA的血清与NK细胞共培养可明显下调NK细胞的杀瘤活性［（76.2±6.7）%vs（48.4±4.1）%］,NK细胞表面NKG2D表达和上清中IFNγ分泌量也下降。IL15明显上调NK细胞表面NKG2D表达,增加培养上清IFNγ分泌量和增强NK对MCF7的杀瘤活性。结论:sMICA表达与乳腺癌TNM分期正相关,sMICA通过下调NK细胞NKG2D表达水平而降低NK细胞杀瘤活性,在肿瘤免疫逃逸中起重要作用。IL15可以上调NK细胞NKG2D的表达并增强NK细胞杀瘤活性。【关键词】自

3、然杀伤细胞;乳腺肿瘤;MICA;NK细胞受体乳腺癌的病因复杂,从免疫学发病机制来看,乳腺癌患者多伴有免疫抑制。NK细胞具有直接杀伤肿瘤细胞的功能,但乳腺癌患者NK细胞功能明显降低［1,2］,可能是导致乳腺癌发生发展的一个因素。NK细胞功能受激活性受体和抑制性受体的双重作用［3］。相对于抑制性受体,活化性受体的研究相对滞后,近年来研究表明活化性受体NKG2D在介导NK细胞的抗肿瘤免疫中发挥重要作用。MICA为NKG2D最主要配体之一,许多恶性肿瘤(如肺癌,胃肠癌,肝癌,前腺癌,多发性骨髓瘤)通过释放可溶性MICA抑制NK细胞的功能［4,5］。我们通过检测乳腺癌患者血清中可溶

4、性MICA水平,观察乳腺癌患者血清中可溶性(solubleMHCclassIrelatedmoleculesA,sMICA)对NK细胞功能的影响,探讨sMICA在乳腺癌免疫逃逸中的作用。1材料和方法1.1材料NK细胞分选试剂盒购自Meltenyi公司;鼠抗人CD3单克隆抗体（mAb）FITC、CD56mAbPE和NKG2DmAbAPC购自BD公司;sMICA的ELISA检测试剂盒(DY1300)购自RD公司;IFNγ的ELISA检测试剂盒购自晶美生物公司;细胞因子IL15购自Cytolab公司;MTT购自Biomo公司;培养液RPMI1640和DMEM购自Gi

5、bco公司。65例乳腺肿瘤患者来自本院2005-10/2007-01住院女性患者,均经病理确诊。其中恶性肿瘤49例（浸润性导管癌24例,髓样癌9例,浸润性小叶癌9例,黏液腺癌7例）,TNM分期按1997年国际抗癌联盟标准:Ⅰ期10例,Ⅱ期12例,Ⅲ期9例,Ⅳ期18例;良性肿瘤16例（纤维腺瘤9例,囊性增生病4例,导管内乳头状瘤3例）,所有患者采集血清前均未进行任何治疗。10例正常对照血清取自健康女性志愿者。乳腺癌细胞株MCF7购自上海细胞所细胞库。1.2方法1.2.1NK细胞的分选、纯化及鉴定参考尹凌凡等［6］方法负向分选纯化NK细胞:Ficoll法分离外周血单个核细胞

6、,加入生物素标记混合抗体孵育10min,离心洗涤,加入抗生物素磁株孵育15min,离心洗涤,使用德国Meltenyi公司VarioMACS系统过柱,收集没有标记的细胞即为NK细胞。流式细胞术（FCM）检测分选前后CD3-CD56+细胞的纯度。NK细胞表面NKG2D的检测,NK细胞经CD3FITC,CD56PE,NKG2DAPC3种不同荧光抗体同时标记,选择CD3-CD56+的细胞群设门,测定CD3-CD56+细胞上的NKG2D的表达水平。1.2.2MTT法检测NK细胞杀伤功能设定效靶比为10∶1,空白组:培养液;靶对照组:MCF7细胞+培养液;效应细胞组:NK细

7、胞+培养液;实验组:NK细胞+MCF7细胞。每组设3个复孔,检测波长为570nm。杀瘤活性率={［1-（实验组-效应对照组）］/(靶对照组-空白组）}×100％1.2.3血清sMICA的测定取外周血3mL于无抗凝干管中,2h之内分离血清,-80℃冰箱保存,根据试剂盒的操作说明书,以双抗体夹心ELISA法检测血清中sMICA含量。1.2.4sMICA对NK细胞NKG2D表达及杀瘤活性影响乳腺癌sMICA(+)患者9例,乳腺癌sMICA(-)患者9例,健康女性9例,取外周血10～20mL,分选NK细胞,参照Doubrovina等