hmgb1在结肠癌免疫逃逸中作用及其机制研究

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1、HMGBl在结肠癌免疫逃逸中的作用及其机制研究摘要目前恶性肿瘤已经成为人类患病死亡的的主因，全球很多的基础医学研究都是围绕着肿瘤开展进行的。近年来人们逐渐认识到肿瘤发生发展的过程在某种程度上也就是肿瘤与宿主相互作用的过程。肿瘤侵袭正常机体组织，同时又离不开机体给予的血供；宿主试图通过免疫攻击清除肿瘤，而肿瘤却利用免疫调节中的各种微妙的机制以逃避免疫监视和攻击，同时也改变着宿主的免疫格局。肿瘤的免疫逃逸机制包括免疫选择和抗原调变、肿瘤细胞表面抗原封闭、肿瘤细胞漏逸和免疫刺激、肿瘤细胞表面的分子表达改变、肿瘤抗原

2、加工、递呈功能障碍、Fas／FasL反击以及分泌各种抑制性的细胞因子如IL．10、TGF．p和FGE2等，或者诱导调节性T细胞或是调节性树突状细胞。现在临床流行病学调查高度提示HMGBl和肿瘤的发生发展，侵袭，转移和肿瘤患者的预后都密切相关。HMGBl与其类似蛋白在刚发现时由于在聚丙烯酰胺胶电泳的高移动性，所以被命名为高迁移性蛋白(highmobilitygroup)。HMGBl在结构上有两个DNA功能域，分别为A．box和B．box，还有一个带负电的羧基端。HMGBl最初被鉴定为DNA体细胞转录调控协同因子

3、。HMGBl在核内能引起DNA构象的变化，促进调节蛋白结合到相应的位点上。在免疫学上具有意义的是HMGBl能以两种方式释放到胞外环境引起及调节炎症反应。一是细胞坏死后扩散，二是细胞的主动分泌。一旦释放到胞外，HMGBl发挥致炎因子作用活化内皮细胞，促进血管形成，炎性细胞和干细胞向血管外的迁移，通过活化一系列关键信号途径从而启动炎症反应，调节细胞的活化、生长及死亡。而HMGBl与肿瘤的关系也是十分密切，在结肠癌患者的样本中，1／3的患者HMGBl基因呈过度表达，其中90．0％患者HMGBl蛋白过度表达，在胃癌标

4、本中，85．0％的样本HMGBI表达阳性，65．0％的样本RAGE阳性，同时发现RAGE的表达主要集中在肿瘤具有侵袭性的组织边缘。在肝癌中，HMGBl与肝癌的分期分级都密切相关，从肝炎，肝硬化到肝癌，病人血清中的HMGBl在相应的病程内成阶梯式上升。HMGBl是TLR4内源性配体，我们先前的研究结果证明肿瘤细胞表面表达的TLR4参与了肿瘤的免疫逃逸。在肺癌中，我们发现TLR4信号能促使人肺癌细胞释放大量免疫抑制性细胞因子，如TGF．B、VEGF、IL一8等，细胞因子作用于肿瘤细胞使其抵抗诱导凋亡，逃避机体的免

5、疫攻击。对于结肠癌，TLR4信号也能通过活化小鼠结肠癌细胞CT26的ERK和NF．r．B信号通路，促进MIP．3(x的分泌，分泌出的MIP．3a第二军医大学硕士学位论文继而通过趋化非成熟DC进入肿瘤周围参与肿瘤免疫逃逸。临床研究提示癌症病人血清中的HMGBl高于正常人，而HMGBl是TLR4的内源性配体。那么，就有是可能肿瘤患者血清中的HMGBl来自于肿瘤细胞，HMGBl通过作用于自身的TLR4促进肿瘤的免疫逃逸。在以上研究背景和假设的基础上我们选取了来源于入或小鼠各种组织的肿瘤细胞株作为研究对象。首先观察了

6、肿瘤细胞分泌HMGBl情况，分析了分泌到胞外的HMGBl对肿瘤自身的效应，以及HMGBl究竟通过怎样的机制促进肿瘤生长和免疫逃逸做了初步的探讨。研究结果发现相对于其它细胞株如肺癌细胞株3LL、黑色素瘤细胞株B16和和乳腺癌细胞株4T1等，小鼠结肠癌细胞株CT26能高分泌HMGBl，我们用胎盼蓝拒染色排除了由于细胞坏死释放的HMGBl。为了观察自分泌的HMGBl的生物学效应，我们用小RNA干扰了HMGBl的表达，转染siRNA48小时后，我们用Westem．blot检测了HMGBl的表达，发现HMGBlsiRN

7、A能明显下调HMGBl蛋白的表达，同时ELISA检测也表明siRNA也能下调HMGBl分泌，大概能下调30％．40％。结肠癌细胞是高分泌IL．6和PGE2，而IL．6和PGE2是非常重要的调节多种细胞增殖、凋亡、迁移和浸润的细胞因子。所以接下来我们用ELISA的方法检测了siI琳A对IL．6和PGE2分泌的影响，发现HMGBlsiRNA能下调IL．6的分泌，但不能下调PGE2的分泌。然后用重组的HMGBl刺激CT26细胞，我们发现，与LPS相似，重组的HMGBI也能上调IL．6和PGE2的分泌。我们先前的实验

8、发现，TLR4能够诱导人肺癌细胞A549，小鼠结肠癌细胞CT26的凋亡抵抗，而HMGBl的受体较多，如TLR4、TLR2和RAGE等。那么HMGBl是否可能通过它的受体诱导结肠癌细胞CT26的凋亡抵抗呢?AnncxinV／PI染色FACS分析表明，当HMGBlsiRNA干扰了CT26细胞HMGBl的表达时，CT26更易被奥沙利铂诱导凋亡。同时我们用重组的HMGBl处理CT26细胞8小时，CT26细胞