MiR221沉默PUMA在膀胱癌免疫逃逸中作用与机制的实验研究

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1、学位论文独创性声明本人声明所呈交的学位论文是本人在导师指导下进行的研究工作及取得的研究成果。据我所知，除了文中特别加以标注和致谢的地方外，论文中不包含其他人已经发表或撰写过的研究成果，也不包含为获得南昌大学或其他教育机构的学位或证书而使用过的材料。与我一同工作的同志对本研究所做的任何贡献均已在论文中作了明确的说明并表示谢意。本学位论文作者完全了解南昌大学有关保留、使用学位论文的规定，有权保留并向国家有关部门或机构送交论文的复印件和磁盘，允许论文被查阅和借阅。本人授权南昌大学可以将学位论文的全部或部分内容编入有关数据库进行检索，可以采用影印、缩印或扫描等复制手段保

2、存、汇编本学位论文。同时授权中国科学技术信息研究所和中国学术期刊(光盘版)电子杂志社将本学位论文收录到《中国学位论文全文数据库》和《中国优秀博硕士学位论文全文数据库》中全文发表，并通过网络向社会公众提供信息服务。(保密的学位论文在解密后适用本授权书)学位论文作者签名(手驰鹕锄签名(手驰侧签字．日期：叫产多月7日签字日期：乃夕年易月夕日I／摘要膀胱癌是泌尿道最常见的恶性肿瘤。根据美国国立卫生院最新统计数据表明：2012年美国膀胱癌新发病例为73510，死亡病例为14880。在我国，尽管无明确的统计数据，但是现有的临床实践和我国老龄化社会问题的逐渐显露，我们有理由推

3、断，在未来的几年内，膀胱癌的发病率必将逐年上升。在膀胱癌的发生发展过程中，癌细胞与宿主经过了免疫监视、免疫平衡、免疫逃逸三个阶段。而癌细胞的免疫逃逸使膀胱癌患者的临床治疗更为复杂。因此，近年来对膀胱癌免疫逃逸机制的研究一直是泌尿系肿瘤领域的重要研究方向。免疫细胞杀死肿瘤细胞过程涉及免疫细胞向肿瘤细胞传递凋亡信号以及凋亡信号在肿瘤细胞内的转导。然而绝大多数有关肿瘤细胞免疫逃逸的研究主要致力于免疫细胞向肿瘤细胞传递凋亡信号受阻方面，如肿瘤细胞抗原的缺失、肿瘤细胞抗原递呈受阻、肿瘤细胞分泌免疫抑制因子和肿瘤细胞表观遗传的改变等。尽管如此，现有的研究表明：免疫细胞向肿瘤

4、细胞传递凋亡信号的通路并未完全受阻，即发生免疫逃逸的肿瘤细胞仍然可部分接受免疫细胞传来的凋亡信号。因此，我们推测膀胱癌细胞内凋亡信号的传递受阻可能是造成膀胱癌细胞发生免疫逃逸的重要原因之一。细胞内信号的调控极其复杂，近十多年的研究发现，微小RNA(microRNA或miRNA)在细胞内信号调控中占据着显赫的地位，其调控机制可概括为：成熟的miRNA组装到沉默复合体并通过碱基互补配对方式识别靶基因mRNA，根据互补程度的不同指导沉默复合体降解靶mRNA或抑制靶mRNA翻译蛋白来调控细胞内信号的传递。而本研究是在前人实验数据证实膀胱癌组织中miR．221表达明显高于

5、正常膀胱组织的基础之上，初步探讨miR．221靶向作用于PUMA基因在膀胱癌免疫逃逸中的分子机制。目的：初步探讨miR．221沉默PUMA在膀胱癌免疫逃逸中的作用方法：检测转染miR．221抑制剂后对人膀胱移行细胞癌T24、5637、J82细胞生长的影响。人工合成2’．O．methyl(OMe)、FAM修饰的miR．221抑制剂(has．miR．221inhibitor)、FAM修饰的无意义阴性对照组序列(Negativecontr01)。将T24、5637、J82细胞各分成3组：①转染miR．221抑制剂组(TansfectionofmiR．221inhibi

6、tor)摘要②阴性对照组(Negativecontr01)③控制组(Contr01)，用转染试剂lipofectamineTM2000，将miR．221抑制剂、NegmivecontrolFAM分别转染T24、5637、J82细胞，采用MTT检测转染24h、48h、72h后细胞增殖活性，选取最优转染时间。转染48h后，qRT-PCR检测miR．221的表达；RT-PCR、western．blot检测miR．221靶基因PUMA及相关凋亡基因Bax、Bcl．2的mRNA、蛋白表达水平；流式细胞术检测细胞凋亡率的改变、AO．EB染色检测细胞凋亡的形态学改变。转染48

7、h后检测细胞侵袭性改变。将人膀胱移行细胞癌T24、5637、J82细胞各分为①转染miR．221抑制剂组(TansfectionofmiR．221inhibitor)②阴性对照组(Negmivecontr01)@控制组(Contr01)，分别转染48h后，采用RT-PCR、westem．blot技术检测MMP．9、MMP．2、VEGF．C的mRNA、蛋白的表达变化。用transwell检测细胞侵袭性的改变。结果：1．转染miR-221抑制剂促进人膀胱移行细胞癌T24、5637、J82细胞发生凋亡①用5．0I_tllip02000包裹100nMmiR．221抑制剂

8、或Negativecon