苦瓜map30基因的克隆表达及对bgc823细胞形态的影响

《苦瓜map30基因的克隆表达及对bgc823细胞形态的影响》由会员上传分享，免费在线阅读，更多相关内容在应用文档-天天文库。

1、苦瓜MAP30基因的克隆表达及对BGC823细胞形态的影响：黄河邵世和,韩晓红,田树伟韩军1,黄世腾【摘要】目的：克隆苦瓜蛋白MAP30基因,并在大肠埃希菌BL21(DE3)中表达,初步研究MAP30蛋白对BGC823细胞的影响。方法:应用PCR技术从苦瓜基因组中扩增出MAP30基因片段,将其TA克隆和双酶切鉴定,再进行测序分析,并构建重组表达载体pET28aMAP30,转化到表达菌BL21(DE3)中,经IPTG诱导,用NTANi2+树脂分离纯化所表达的MAP30融合蛋白,并经SDSPAGE电泳鉴定;纯化的蛋白作用于BGC823细

2、胞后通过光镜和电镜进行形态学观察。结果:成功扩增出MAP30基因为861bp,与基因库中公布的DQ643967同源性为100%,与DQ643968和S79450的同源性为99%;成功构建pET28aMAP30原核表达重组质粒;通过NTANi2+树脂分离纯化目的蛋白,获得原核表达的大小约为30000的MAP30融合蛋白,与预测一致;蛋白作用细胞后,细胞形态有明显变化。结论:成功构建pET28aMAP30表达载体并获得原核表达的MAP30融合蛋白;重组MAP30蛋白能引起BGC823细胞明显的形态学变化。【关键词】苦瓜;MAP30;克隆;

3、BGC823细胞;凋亡;电镜　　[Abstract]Objective:ToclonetheMAP30geneandtoexpressitinE.coliBL21(DE3)andtodetecttheinfluenceoftheMAP30proteinonproliferationinBGC823cells.Methods:Polymerasechainreaction(PCR)plifytheMAP30genefrombitterguardgenomeDNA.ThenthetargetgeneedintoE.coliDH5αandident

4、ifiedbyrestrictiondigestionandDNAsequencing.ThentheMAP30genefragmentedintoE.coliBL21.ThehisMAP30fusionproteinnandidentifiedbySDSPAGE.Themorphologicalchangeofcellicroscopeandtheelectronmicroscope.Results:DNAsequenceanalysisshoologyedintoE.coliBL21.Thefusionproteinmol/LIPTGin

5、ductionfor5hours.Theproteinnolecularorphologicalchanges.Conclusions:TheprokaryoticexpressionvectorpET28aMAP30E.coliBL21.TherebinantMAP30proteincancausethemorphologicalchangeofBGC823cellssignificantly.　　[Keyordicacharantia(MC);MAP30;cloning;BGC823cell;apoptosis;scanningele

6、ctronmicroscope(SEM)　　苦瓜属于葫芦科植物,主要分布于热带和亚热带地区,含有很多活性成分,其中包括一种核糖体失活蛋白MAP30。MAP30是含有263个氨基酸的单链蛋白,具有抗HIV、抗肿瘤[1]和抗菌活性[2],经过限制性蛋白水解后的片段仍具有这些活性[3],而且,重组蛋白具有与天然蛋白相同的功能和活性[2]。国外已经利用pRSET原核载体和ZYMVAGII病毒载体在相应的表达体系中对MAP30基因进行表达,获得的重组MAP30蛋白同样具有抗病毒、抗肿瘤和抗菌活性[2]。国内对于重组MAP30蛋白做了很多研究,甚至对不同苦

7、瓜品种的MAP30基因进行克隆及序列分析[4]。最近研究表明,重组MAP30在体外还能抑制乙型肝炎病毒复制[5]。本文通过MAP30基因的克隆和生物信息学分析,构建原核表达载体,表达MAP30重组蛋白,并研究了重组MAP30蛋白对BGC823细胞形态的影响。　　1材料和方法　　1.1材料　　1.1.1菌种及载体克隆载体pGEMT购自Progema公司;原核表达载体pET28a及宿主菌E.coliDH5α和BL21(DE3)菌株由江苏大学检验医学研究所保存;胃癌细胞BGC823由本实验室保存。　　1.1.2试剂和仪器引物由上海生工生物工程有

8、限公司合成;T4DNA连接酶及DNAGel纯化试剂盒均为Promega公司产品;限制性内切酶EcoRI和XhoI、DL2000DNA标准