midkine特异的shrna对胃肿瘤细胞bgc823增殖及凋亡的影响

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1、Midkine特异的shRNA对胃肿瘤细胞BGC823增殖及凋亡的影响作者：王庆苓，黄亚红，柳红，侯亚义【摘要】目的研究shRNA干扰midkine对胃肿瘤细胞BGC823增殖能力及凋亡的影响。方法构建midkine基因的特异性小RNA干扰质粒，采用脂质体2000转染BGC823细胞，运用CCK-8检测细胞的增殖能力，PI染色检测细胞凋亡情况。结果成功转染重组体的BGC823细胞增殖明显受到抑制(P<0.01)细胞形成克隆数明显降低(P<0.01)，并且有明显的亚二倍体峰出现(P<0.05)。结论针

2、对midkine基因的特异性小RNA干扰质粒在体外能有效抑制人胃癌细胞BGC823midkine表达，细胞增殖能力减弱，细胞凋亡增加，为midkine基因靶向治疗提供一定的实验依据。【关键词】midkine;shRNA;胃肿瘤细胞;细胞增殖;细胞凋亡　　Abstract:ObjectiveToinvestigatetheeffectofknockdownofmidkine(MK)expressionbyshRNAoncellproliferationandapoptosisofhumangastriccarcinom

3、acellBGC823.MethodsSpecificshRNAplasmidstomidkinewereconstructed,andwerethentransfectedintoBGC823bylipofectamin2000.ThecellproliferationwasevaluatedbyCCK-813kit,andtheapoptosiswasdeterminedbyflowcytometricanalysis.ResultsTherecombinantplasmidexpressingmidkinesh

4、RNAeffectivelyinhibitedBGC823cellproliferation(P<0.01)anddecreasedcloneformation(P<0.01)andsignificantlypromotedcellapoptosiswiththeemergenceofsub-diploidpeak(P<0.05).ConclusionshRNAplasmidstargetingMKgenecaninhibitthegrowthofhumangastriccancercellsbya

5、ttenuatingcellproliferationandinducingapoptosis,whichmightprovideexperimentalevidenceforgenetargetingtherapyofMK.　　Keywords:midkine;shRNA;gastriccancercell;cellproliferation;apoptosis　　Midkine(MK)是一种肝素结合生长因子，MK在多种正常组织中也有表达，在小肠黏膜组织高表达，在肺、结肠、胃、肾和脾低表达，在肝脏中没有表达，MK在

6、多种肿瘤组织中的表达比相应的癌旁和正常组织高[1]。在我们前期研究工作[2]中发现MK在中国胃肿瘤患者的肿瘤组织中高表达，并与临床分级相关。在多种肿瘤细胞系中，MK具有促纤溶、促血管形成和抗凋亡作用，能诱导NIH/3T3细胞、SW-13细胞和UNUC3细胞转化[1,133]。胃癌患者的尿液和血清中的MK水平都有所增加[4-5]，肿瘤切除后血清MK水平就会下降[6]。这些资料表明MK与胃肿瘤的发生发展相关，可作为诊断指标和治疗靶标。本研究旨在以MK为靶标进行干扰，观察MK干扰后胃肿瘤细胞增殖及凋亡情况。　　1材料和方法

7、　　1.1材料　　1.1.1肿瘤细胞BGC823细胞株购自中国科学院细胞所。　　1.1.2pSilencer2.1U6和pSilencer3.1H1载体pSilencer2.1U6和pSilencer3.1H1载体购自Ambion公司，pSilencer2.1U6的载体含有U6RNA聚合酶Ⅲ启动子;pSilencer3.1H1载体含有H1RNA聚合酶Ⅲ启动子。两者都同时含有氨苄青霉素和G418抗性基因，前者可用于在原核细胞的筛选，后者则可用于在真核细胞的筛选。2个载体在购买时呈开环的线状，两端分别留有BamHI和Hi

8、ndⅢ的酶切位点。　　1.1.3主要试剂PI为南京凯基生物公司产品;Llipofectamin2000转染试剂和Opti-MEM购自Invitrogen公司;各种限制性内切酶、总RNA提取试剂盒、质粒抽提试剂盒、反转录试剂盒、核酸电泳试剂均为TaKaRa公司产品;PCR扩增试剂为天为时代公司产品。13　　1.2方法　　1.2.1发夹状双链MK-