恒河猴cd1d基因的克隆及其组织表达差异性分析

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1、恒河猴CD1d基因的克隆及其组织表达差异性分析：张萍,周慧芳,孙正华,邵晓丽,张华堂,徐小宁【摘要】目的:克隆非人灵长类疾病动物模型恒河猴的CD1d基因并检测其在不同组织中的表达差异情况。方法:提取恒河猴血液及各组织的RNA,以反转录得到的cDNA为模板,用特异性引物扩增CD1d;以管家基因GAPDH为内参,用半定量RTPCR的方法对CD1d的组织表达差异性进行分析。结果:成功扩增了恒河猴CD1d基因的编码区序列;首次用半定量RTPCR的方法检测了CD1dmRNA在恒河猴部分组织中的表达情况,发现其表达水平存在明显的组织差异性,其中,在肝脏、脾脏和

2、心脏中的表达水平较高,在血液、小肠和肺中次之,在脑中表达最少。结论:研究结果为今后表达恒河猴CD1d蛋白并制备其四聚体进而研究恒河猴NKT细胞在众多疾病中的作用奠定了基础;组织表达差异的研究结果提示其在相关疾病的发生发展过程中可能扮演着重要的角色,具体作用还有待深入研究。【关键词】CD1d;NKT细胞;恒河猴;组织分布［Abstract］AIM:ToamplifytheCD1dandanalyzeitstissuedistributioninRhesusmacaque.METHODS:ExtractingtotalRNAfromdifferenttiss

3、uesofRhesusmacaque.CD1damplificationersandtissuedistributioniquantificationRTPCR,usingthehousekeepinggeneGAPDHasaninternalcontrol.RESULTS:TheCD1dcodingregionentandtissuedistributionallintestineandstomach,andleastinbrain.CONCLUSION:ThesuccessfulamplificationofCD1disusefultoprod

4、uceantiCD1dantibodyandCD1dtetramertostudyNKTcellsinRhesusmacaque.TheexpressionprofileofCD1dmRNAinRhesusmacaqueisinaccordanceportantinsightsforfutureresearchontherelationshipofCD1d/NKTcellsandtheirrolesindifferenttissues.［Keyacaque;TissuedistributionCD1家族是一类非经典的抗原递呈分子,包括CD1a、b、c

5、、d和e5个成员,其中CD1a、b、c和e属于第Ⅰ组,CD1d属于第Ⅱ组。在灵长类中两类CD1分子均有表达,但在小鼠等啮齿类动物中仅表达CD1d,称为CD1d1［1］。CD1家族成员在进化中表现的非常保守。与经典的抗原递呈分子MHCⅠ结构类似,CD1d分子也包括胞膜外区（α13）、跨膜区和胞质区,并通过重链α3结构域与β2m非共价结合形成异源二聚体发挥抗原递呈的功能;与MHCⅠ不同的是,CD1d递呈的是脂类抗原,而非肽类抗原。作为抗原递呈分子,CD1d可以将外来或自身的脂类抗原递呈给CD1d限制性的NKT细胞。NKT细胞是一类数量很少但很重要的免疫细

6、胞,在细胞免疫和体液免疫中均起重要作用［2］。鉴于NKT细胞表现出的CD1d限制性,承载αGalCer（一种从海绵中提取的鞘糖脂）的CD1d四聚体已经成为检测和认定NKT细胞的关键性标记之一［3］,因此,克隆并表达功能性的CD1d已经成为研究NKT细胞的重要环节。目前,许多物种的CD1d基因序列已经得到了公布,其编码区长度在不同物种中稍有差别,人的CD1d基因编码区全长有1008bp,恒河猴为1014bp,小鼠CD1d为1011bp。尽管如此,不同物种间CD1d的同源性及功能上均表现了高度的保守性。有研究表明,CD1d分子主要表达在脾细胞、树突状细胞（

7、DC）和胃肠道上皮细胞上。Canchis等［4］曾通过免疫组化染色方法检测到人的CD1d在小肠、肝脏、胰脏、肾脏、胃以及皮肤等组织中均有表达。Kasai等［5］结合原位杂交及免疫组化方法发现在大鼠的脾脏、胸腺、肝脏、肺、心脏、肾脏、小肠等组织中均有CD1d1的表达。但尚未见到关于恒河猴的CD1d组织表达差异情况的详细报道。本试验中,我们对人类疾病发生和治疗等研究中被广泛应用的非人灵长类动物模型恒河猴的CD1d分子进行了克隆和研究。成功克隆了恒河猴的CD1d编码区序列,并首次用半定量RTPCR的方法检测了部分组织中CD1d的表达情况,为今后研究CD1d

8、/NKT细胞的分布及其在不同组织中的功能特点给出了提示。1材料和方法1.1材料恒