扁桃花粉acsfb基因的克隆及其表达分析

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1、新疆农业大学硕士学位论文扁桃花粉AcSFB基因的克隆及其表达分析姓名：郭长奎申请学位级别：硕士专业：生物化学与分子生物学指导教师：罗淑萍20090601扁桃花粉彳册基因的克隆及其表达分析摘要扁桃(AmygdaluseommunisL．)属蔷薇科李亚科桃属扁桃亚属植物，是典型的配子体自交不亲和树种。已有的研究表明，S-RNase基因是花柱自交不亲和决定子基因，SFB基因是花粉决定子基因。本研究以新疆栽培扁桃为材料，利用分子生物学技术克隆扁桃花粉自交不亲和基因-s单元型F．box蛋白基因AcSFB(A．com

2、munisShaplotype．specificF．boxprotein，AcSFB)，并确定其单元型和表达的组织特异性，初步确定原核表达分析AcSFB蛋白表达情况，为扁桃授粉树的配置、自交亲和品种的选育以及果树配子体自交不亲和的分子机理研究奠定理论基础。主要研究结果如下：1．建立了一种简单快速提取扁桃花药RNA的方法。该法简单有效，获得的扁桃花药总RNA完整性好、无多糖和蛋白质的污染，并且产量较高。‘2．从新疆栽培扁桃中克隆到了15个全长的AcSFB基因(GenBank登录号：EU909685、FJ36

3、2524～FJ362529、FJ231204、FJ415321和FJ514935～FJ514940)，BLAST比对分析显示，AcSFB基因具有高的基因多态性。生物信息学分析表明，推测的AcSFB氨基酸序列在N末端含有一个大约50个氨基酸组成的F．box基序，含有两个高变区(Hva和Hvb)和两个可变区(Vl和V2)，被认为是与自交不亲和相关，为与S．RNase相互识别的位点。预测AcSFB蛋白为不稳定、亲水性和非分泌型蛋白，在基质内起连接酶或裂合酶的作用，在主要中间产物新陈代谢和能量代谢中起重要作用。3

4、．F-box基因系统发育树的构建结果表明，李属之间SFB基因具有较高的同源性，扁桃AcSFB基因无地域性差异，与矮牵牛和金鱼草SLF基因具有明显的区别。4．AcSFB基因组织特异性分析表明，其只在花药中特异表达，在其它组织中不表达。半定量RT-PCR分析显示，Ac陋8基因在气球期表达最多，推断在这个时期AcSFB蛋白的表达量也达到了一个比较高的水平，自交不亲和品种在这个时间授粉成功率很低可能就是由此引起的。基因组分析表明，AcSFB基因没有内含子的存在，只是在基因的5’端有内含子的存在。同时，本文分离到了

5、5个扁桃AcSFB基因5'UTR片段，将对AcSFB基因单元型的确定和授粉树的配置提供理论参考。5．本文成功构建了原核表达载体pET_AcSFB，并转化大肠杆菌BL21(DE3)，IPTG诱导后，SDS．PAGE检测结果显示表达了一个约60kD的蛋白。为进一步纯化和鉴定SFB蛋白研究奠定了基础。关键词：扁桃：自交不亲和；AcSFB基因；生物信息学：表达分析TheCloningandExpressionAnalysisofPollenAcSFBGenesfromAlmond似mygdaluscommunis

6、L．)AbstractAlmond似mygdaluscommunis工)isthediploidmemberofRosaceaeandiscross-pollinatdandself-incompatibleplant．StyleS—determinantshavebeendeterminedtobeS-RNaseandtheSFB(S-haplotype—specificF-boxproteingene)allelesareconsideredtobethefirstcandidatesofthepol

7、lenS-determinants．NowthereisnotanyresearchofalmondpollenGSIinXinjiang．Inthisstudy，theinitialaimWaStoisolateandcharacteriseAcSFBallelegenesfromalmondcultivarinXinjiang．China,togainfurtherunderstandingoftheevolutionaryrelationshipsandphylogenyofSFBalleleswi

8、thinPrunus．Expressionanalysisandsemi·-quantitativeRT·PCRwereusedtofindwhichtissuecouldexpressSFBproteinandwhichfloweringperiodexpressedmore．5’UTRand3’UTRanalysisandbioinformaticsanalysisstillhadstudiedinthisexpedmen