香鱼LECT2基因的克隆及其组织表达差异

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1、细胞生物学杂志ChineseJournalofCellBiology2009,31(2):277-280http://www.cjcb.org香鱼LECT2基因的克隆及其组织表达差异杨红艳　陈　炯*　史雨红　李明云(宁波大学应用海洋生物技术教育部重点实验室,宁波315211)摘要LECT2(leukocytecell-derivedchemotaxin2)是一个多功能的蛋白质，其与细胞生长、分化、损伤修复及免疫等过程相关。本研究通过设计简并引物,从香鱼肝脏cDNA文库中筛选LECT2基因,该基因cD

2、NA序列全长547个核苷酸,3'末端具有polyA尾,单一大开读框编码一个由156个氨基酸组成的分子量为17kDa的蛋白质。序列分析及系统进化树分析均表明,香鱼LECT2与虹鳟LECT2最相似,且各物种LECT2的进化关系与目前接受的物种分类关系基本一致。香鱼LECT2基因在香鱼许多组织中均有表达,而肝脏中的表达量最高,肾脏和脑中的表达量也较高。关键词LECT2;克隆;序列分析;mRNA表达谱LECT2(leukocytecell-derivedchemotaxin2)最1.1.1实验动物健康香鱼5

3、尾,个体体重20~25早分离自人T细胞SKW-3株培养液,它具有嗜中性g,购自宁波水产大世界。粒细胞趋化活性[1]。人LECT2分子量为16kDa,含1.1.2菌株、载体和质粒大肠杆菌TG1菌株和三个分子二硫键,在人肝脏中特异表达并分泌到血液载体pBluescriptSKII(+)由本实验室保存。中[2]。新近的研究揭示,LECT2可能是一个多功能1.1.3主要试剂及耗材TDNA连接酶、RNAiso4的蛋白,其与细胞生长、分化、损伤修复及免疫等试剂、Oligotex-dT30mRNAP

4、urification过程相关[3~6]。近年来,采用同源克隆和EST等分子Kit、限制性内切酶、ExTaqDNA聚合酶和cDNA生物学技术,人们已克隆并测定了牛(Bostaurus)[2]、LibraryConstructionKit等均购自TaKaRa公司;Gel小鼠(Musmusculus)[7]、鲤鱼(Cyprinuscarpio)[8]、虹ExtractionKit购自Omega公司。鳟(Oncorhynchusmykiss)[9]、斑马鱼(Daniorerio)[5]和1.1.4引物合成

5、及序列测定引物合成及序列测大黄鱼(Pseudosciaenacrocea)[6]等物种的LECT2基因。定由上海英骏生物工程公司完成。香鱼(Plecoglossusaltivelis)是东亚地区如中国、1.2方法日本和朝鲜等国特有的一种中小型名贵鱼类,虽然其1.2.1香鱼LECT2基因cDNA序列的获得用养殖面积逐年扩大,但高密度的人工养殖导致病害频RNAiso试剂提取香鱼肝脏总RNA,用Oligotex-dT30发,这些病害已成为制约香鱼养殖产业发展的瓶颈。纯化mRNA,以其为模板,

6、采用cDNALibrary因此,对香鱼免疫相关基因的研究日益受到重视[10,11]。ConstructionKit构建香鱼肝cDNA文库,方法参照厂研究表明,杀鲑气单胞菌(Aeromonassalmonicida)和家说明。根据已报道的动物LECT2保守序列设计简金黄色葡萄球菌(Staphylococcusaureus)急性侵染试验并引物dL(+):5'-GTXTAYGCXCCXTTYGAYGT-3',中,染病斑马鱼的肝脏中LECT2mRNA水平上升高达其中X=A,T,C,G;Y=T,C。随机挑选2

7、87个克隆,1000倍[5];溶藻弧菌(Vibrioalginolyticus)侵染的大黄用dL(+)和文库载体质粒pBluescriptSKII(+)引物鱼肝脾中LECT2mRNA表达水平也有显著增加[6],这T7配对做PCR检测,阳性克隆测序并经BLASTP些结果提示LECT2在鱼类免疫过程中可能起着重要(http://www.ncbi.nlm.nih.gov/BLAST/)分析。作用。因此,本文拟克隆香鱼LECT2(aLECT2)基1.2.2序列分析信号肽序列预测采用SignalP因cDNA序

8、列,并检测其组织表达差异性,从而为进3.0[12],多重序列比对采用ClustalW程序(http://一步研究鱼类LECT2的结构、功能和作用机制打下基础。收稿日期:2008-11-05　　接受日期:2009-02-25国家973前期研究专项(No.2008CB117015)、长江学者和创新团队1材料与方法发展计划(No.IRT0734)和宁波市科技局项目(No.2007C10081)资助*通讯作者。Tel:0574-87609571,Fax:0574-876001