天府肉羊ctsd和cstb基因克隆及其组织表达测定

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1、万方数据SichuanAgriculturalUniversityMasterDegreeDissertationeDNAcloningandtissueexpressionofCTSD、CSTBinTianfugoatByNianluWang(AnimalGenetics，BreedingandReproduction)DirectedbyGangYiXuCollegeofAnimalScience&Technology,SichuanAgriculturalUniversityYa’an，Sichuan，RR．ChinaJune，2014万方数据本研究由4IIIII

2、IllIIIIlllllllIIIllIllIllIlllJ0120852国家现代肉羊产业技术体系¨十二五¨项目(CARS．39)四川省“十二五”畜禽育种攻关项目(2011NZ0099．34)四川青年基金项目(2013JQ0022)提供资助本研究在四川农业大学“畜禽遗传资源发掘与创新利用四川省重点实验室”完成万方数据附件一论文独创性声明本人郑重声明：所呈交的学位论文是我个人在导师指导下进行研究工作所取得的成果。尽我所知，除了文中特别加以标注和致谢的地方外，学位论文中不包含其他个人或集体己经发表或撰写过的研究成果，也不包含为获得四川农业大学或其它教育机构的学位或证书所使用

3、过的材料。与我一同工作的同志对本研究所做的任何贡献均己在论文中作了明确的说明并表示了谢意。研究生签名：互．念砺疆讼f争年衫月／-日关于论文使用授权的声明本人完全了解四川农业大学有关保留、使用学位论文的规定，即：学校有权保留并向国家有关部门或机构送交论文的复印件和电子版，允许论文被查阅和借阅，可以采用影印、缩印或扫描等复制手段保存、汇编学位论文。同意IⅡtJII农业大学可以用不同方式在不同媒体上发表、传播学位论文的全部或部分内容。口本论文不保密。(请在以上口内划tc、／’’)研有毕答幺．王公说研究生签名：业“介。妙弘导师签名：乡纠础口本论文保密，在一年解密后适用本授权。加

4、，≯年6月t2ElⅪc争年6月f明万方数据摘要组织蛋白酶D(CTSD)是影响肌肉嫩化且勺重要物质之一，胱氨酸蛋白酶抑制剂B(CSTB)是半胱氨酸蛋白酶抑制基因家族的代表性基因，主要通过抑制蛋白酶活性从而影响到肉的品质嫩度。本试验在天府肉羊中首次选择CTSD和CSTB基因运用分子克隆技术进行CDS区的克隆，并提交至NCBI获得登录号为：KJ004415和KF991243，随后采用实时荧光定量RT-PCR技术检测这两个基因的mRNA在天府肉羊的心脏、肝脏、脾脏、肺、肾脏、股二头肌、腹直肌和背最长肌八个组织中的表达，继而检测了这两个基因在天府肉羊不同时间段的表达，并用蛋白印迹

5、杂交技术在蛋白水平检测了它们在天府肉羊各个组织中的表达情况。结果显示CTSD基因完整的开放阅读框为1239bp，共编码412个氨基酸，该氨基酸拥有20个磷酸化位点，预测的蛋白二级结构主要无规卷曲和延伸链，CTSD蛋白存在信号肽、A1前体结构域和结构域，这个结构与蛋白在．PropeptideAspCTSD其他物种上研究相符合，系统进化树分析显示其与牛的基因同源性最高，与物种间的同源性和生物进化关系亲源性的远近也相符合，实时荧光定量RT-PCR结果显示在8个试验组织中，CTSD基因在肺中的表达量最高，其次是肝脏和肾脏，在股二头肌、腹直肌和背最长肌三种骨骼肌中的表达量最低，而

6、且在背最长肌中，CTSD基因随着时间的增长其表达量呈现出先上升后下降的趋势，在12月龄达到最高点，后经蛋白印记杂交分析后也仅在股二头肌、腹直肌和背最长肌中检测到目的条带。CS乃基因的完整开放阅读框为306bp，共编码101个氨基酸，CSTB蛋白拥有3个磷酸化位点，预测的蛋白二级结构也是以无规卷曲和仪．螺旋为主，并且不存在信号肽，预测到存在Cystatin．1ike结构域，在系统进化树分析显示天府肉羊CSTB蛋白与牛的CSTB蛋白有很近的进化关系和遗传关系，并与其他物种间的同源性、生物进化关系亲源性的远近也相符合，实时荧光定量RT-PCR结果显示在天府肉羊8个试验组织中，

7、CS船基因在肺的表达量最高，其次是脾脏，同样在股二头肌、腹直肌和背最长肌三种骨骼肌中的表达量最低，在背蕞-长肮中CSTB基因随着天府肉羊年龄的增长其表达量出现先上升后下降的趋势，同样是在12月龄达到最高点，之后开始下降，而蛋白印迹杂交结果显示仅在心、肝、脾、肺和肾中检测到CSTB蛋白条带。关键词：天府肉羊；CTSD基因；CSTB基因f基因克隆：表达分析万方数据cDNAcloningandtissueexpressionofCTSD、CSTBinTianfugoatNianluWang．(山nimatGenetics，Breedingand