chk1反义寡核苷酸增加hela细胞顺铂作用下凋亡敏感性

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1、chk1反义寡核苷酸增加HeLa细胞顺铂作用下凋亡敏感性【摘要】　　目的：通过反义封闭chk1基因，阻断细胞周期检测点信号传导通路，从而增加宫颈癌HeLa细胞对顺铂(DDP)的敏感性.方法：采用MTT法检测梯度浓度DDP作用人宫颈癌细胞株HeLa24,48和72h后对细胞的生长抑制率.以脂质体为载体将chk1正义链和反义链转染HeLa细胞，用:Toinvestigatetheeffectofchk1geneincisplatinresistanceofcervicalcancertoblockthesignaltransduct

2、ionpatheasuredbyMTTassay.OligonucleotideetryandTUNEL.RESULTS:Thegroeandconcentrationdependentmanner.Transfections;DDP　　0引言　　宫颈癌是世界范围内女性第二大恶性肿瘤.近年来以顺铂（cisplatin，DDP）为核心的联合化疗在宫颈癌治疗中取得了一定进展.有研究认为，细胞周期检测点途径主要由ATM，ATRChk1/2Cdc25A，Cdc25B，Cdc25C轴组成［1］，细胞周期检测点激酶1(checkpoint

3、kinase1，Chk1)属于丝氨酸/苏氨酸激酶,是细胞周期检测中最关键的效应蛋白激酶［2］.以chk1为作用靶点,干扰细胞损伤修复机制,提高肿瘤治疗的敏感性可能成为一种有效的治疗选择.我们以chk1反义寡核苷酸链转染HeLa细胞，观察其化疗后的凋亡敏感性.　　1材料和方法　　1．1材料　　人宫颈癌HeLa细胞株由西安交通大学医学院第一附属医院临床研究医学分子中心提供.在37℃,50mL/L的CO2条件下用含100mL/L胎牛血清的RPMI1640培养基培养.RPMI1640购自Gibco公司；胎牛血清购自杭州四季青生物工程材料有

4、限公司；MTT购自Amressco公司；转染试剂LipofectamineTM2000购自美国Invitrogen公司；鼠抗人Chk1mAb购自Neomarkers公司；辣根酶标记的羊抗鼠抗体购自博士德公司；ECL购自AmershamBioscience公司；AnnexinVFITC试剂盒购自北京博奥森生物技术有限公司；原位细胞凋亡检测试剂盒购自华美生物公司.　　1．2方法　　实验分4组：正常对照组(A组)，细胞未经任何处理；空脂质体组(B组)；转染chk1正义寡核苷酸链组(C组)；转染chk1反义寡核苷酸链组(D组).B~D组

5、转染后用20μmol/LDDP处理24h.　　1．2．1　MTT法检测　　DDP对细胞的生长抑制率取对数生长期的HeLa细胞，调整细胞密度5×107/L，接种于96孔板,200μL/孔,培养24h后DDP终浓度为10,20,40,80和160μmol/L,每个浓度设4个平行孔，并同时设阴性对照(不加药物)和空白对照（无细胞），分别于作用24,48和72h后加入5g/L的MTT溶液，20μL/孔，继续培养4h后，吸去上清，加入二甲基亚砜，150μL/孔，振荡器震荡10min，使结晶溶解完全，用酶标仪在490nm波长处测量A值，计算细

6、胞增殖抑制率（%）.绘制DDP对HeLa细胞的生长抑制曲线.　　1．2．2　转染效率的检测　　chk1反义寡核苷酸序列根据　　我们首先分析了DDP对宫颈癌HeLa细胞的生长抑制作用，结果显示DDP对HeLa细胞生长有明显的抑制作用，且随着时间的延长和浓度的增加，其抑制作用越来越明显，呈时间浓度依赖性特点.然后我们以chk1为研究对象，合成chk1反义寡核苷酸，以脂质体介导转染HeLa细胞，封闭Chk1蛋白表达，检测DDP作用下细胞凋亡情况.由于脂质体和寡核苷酸的毒性可诱导细胞的非特异性凋亡，我们同时合成chk1正义寡核苷酸，以转染

7、chk1正义寡核苷酸组和空脂质体组作为对照，并通过转染效率的检测确定了最佳转染条件，以准确反映chk1反义寡核苷酸对细胞的特异性促凋亡作用.我们的研究结果显示：Chk1在转染反义寡核苷酸的细胞中的表达明显降低，说明Chk1蛋白的表达可受chk1反义寡核苷酸有效抑制，而不受其正义链的影响.转染chk1反义寡核苷酸可特异性促进DDP诱导的细胞凋亡.Bull等［9］报道的分子伴侣Hsp90抑制剂17DMAG通过抑制Chk1表达，使3株人肿瘤细胞的放射敏感性增加，在体内可以抑制照射后肿瘤的生长.国内有研究报道chk1反义寡核苷酸可明显提

8、高白血病细胞对药物治疗的敏感性［10］，与本实验结果一致.【