chk2反义寡核苷酸对顺铂诱导卵巢癌skov3细胞凋亡的影响

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1、chk2反义寡核苷酸对顺铂诱导卵巢癌SKOV3细胞凋亡的影响作者：朱克修，李玢，王佳，韩晓兵【摘要】目的：观察卵巢癌SKOV3细胞转染chk2反义寡核苷酸后在顺铂作用下细胞凋亡的变化.方法：用MTT法检测不同浓度顺铂对SKOV3细胞的抑制率，I1640购自Gibco公司，胎牛血清购自杭州四季青生物工程材料有限公司，噻唑蓝（MTT）购自Amressco公司，转染试剂Lipofectamine2000购自Invitrogen公司，鼠抗人Chk2mAb购自NEOMARKERS公司，辣根酶标记羊抗鼠二抗购自博士德公司，原位细胞凋亡检测

2、试剂盒购自华美生物工程公司.1.2方法1.2.1细胞培养人卵巢癌细胞SKOV3常规培养在含100mL/L胎牛血清的RPMI1640培养基中，培养条件为37℃，50mL/LCO2饱和湿度，待细胞长满瓶底时，2.5g/L胰蛋白酶消化传代.1.2.2MTT法测定不同浓度顺铂在不同时间对SKOV3细胞生长的抑制率取对数生长期的SKOV3细胞，调整细胞密度为5×107/L，接种于96孔板,200μL/孔,37℃，50mL/LCO2培养箱中培养24h后加药，使顺铂终浓度为10，20，40，80，160μmol/L,每个浓度设四个平行孔，

3、并同时设不加药物的阴性对照和无细胞的空白对照，分别于作用24，48，72h后加入20mmol的MTT溶液，20μL/孔，继续培养4h后，吸去上清，加入DMSO，150μL/孔，振荡器震荡10min，使结晶溶解完全，用酶标仪(650BIORAD公司)在490nm处测量A值，计算细胞增殖抑制率（inhibitionrate,IR%）.绘制顺铂对SKOV3细胞的生长抑制曲线.1.2.3脂质体介导寡核苷酸转染SKOV3细胞株1.2.3.1寡核苷酸链的设计和合成根据图3chk2反义寡核苷酸对SKOV3细胞Chk2蛋白表达的影响2.4转

4、染chk2反义寡核苷酸对SKOV3细胞早期凋亡的影响40μmol/L顺铂处理各组细胞24h后，流式细胞仪检测转染chk2反义链组细胞凋亡率为（77.6±1.7）%，明显高于正常组（24.7±1.76）%，空脂质体组（35.6±1.4）%及转染正义寡核苷酸细胞组（47.6±1.2）%（P<0.05）.说明转染chk2反义寡核苷酸可诱导SKOV3细胞的凋亡增加.TUNEL染色后，转染chk2反义寡核苷酸链后SKOV3细胞在顺铂作用下凋亡细胞数明显高于正常组，空脂质体组和转染chk2正义寡核苷酸链组凋亡细胞数（图4）.检测结果

5、与AnnexinV/PI流式细胞仪检测法获得结果一致.A：正常组；B：转染空脂质体组(LP)；C：转染chk2正义链组（chk2odn组）；D：转染chk2反义链组（chk2Asodn组）.图4TUNEL法检测顺铂处理24h后各组细胞的凋亡×403讨论由于对卵巢癌仍缺乏有效的早期诊断方法，多数患者确诊时已属晚期，卵巢癌亦成为死亡率最高的妇科恶性肿瘤.手术治疗后辅以化学治疗是目前卵巢癌的标准治疗方案，然而，肿瘤对化疗药物的耐药常导致治疗失败.有报道约15%的卵巢癌患者对化疗原发性耐药，至少80%的卵巢癌患者最终形成多种药物联合化疗的耐

6、药.研究发现，肿瘤细胞的多耐药性以成为恶性肿瘤化疗失败的重要原因之一［1］，因而进行化疗增敏或寻找新的治疗手段具有重要意义.chk1/chk2在细胞周期检测点中起重要作用.国外一些研究表明通过阻断chk1/chk2可以明显增加肿瘤细胞的凋亡［6-8］.大量研究表明，chk1,2主要在G2/M期检测点发挥作用［9］.DNA受损后，活化的chkl/2磷酸化CDC25上的Sevr216，使其形成与1433蛋白质结合的位点，从而阻止CDC25的去磷酸化作用.如此cdc2因未脱磷酸化不具活性最终影响cdc2与CyclinB构成的活性复合体

7、从而引起G2M期阻滞［10-11］.卵巢癌细胞对化疗药物的耐药是治疗失败的重要原因.为了证明chk2是否是卵巢癌增敏治疗的有效靶点，通过反义寡核苷酸杂交技术，合成chk2反义寡核苷酸链，经过杂交，用TT法检测不同浓度的顺铂在不同时间点对卵巢癌SKOV3细胞的抑制率的变化.通过本试验，我们了解到顺铂对SKOV3细胞的抑制率随时间和浓度的增加上升.并计算出DDP作用24h的IC50值为37.2μmol/L.所以我们在后面的实验中均选择用40μmol/L顺铂处理SKOV3细胞24小时.并通过检测chk2反义寡核苷酸转染细胞的效率，

8、获得一个最佳的寡核苷酸和脂质体的比例，使实验结果更加稳定可靠.以上结果表明DNA/Lipofectamine2000脂质体比率为0.6μg/2μL,0.8μg/2μL和1.0μg/2μL时的转染效率均接近100%.我们选择寡核苷酸/L