chk2反义寡核苷酸对顺铂诱导卵巢癌SKOV3细胞凋亡的影响.doc

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1、chk2反义寡核苷酸对顺铂诱导卵巢癌SKOV3细胞凋亡的影响作者：朱克修，李玢，王佳，韩晓兵【摘要】目的：观察卵巢癌SKOV3细胞转染chk2反义寡核苷酸后在顺铂作用下细胞凋亡的变化.方法：用MTT法检测不同浓度顺铂对SKOV3细胞的抑制率，WesternBlot法检测SKOV3细胞中Chk2蛋白的表达.流式细胞仪及TUNEL法检测转染chk2反义寡核苷酸后顺铂作用下SKOV3细胞凋亡情况.结果：顺铂对SKOV3细胞的生长抑制率随浓度增高和时间延长而升高.WesternBlot法检测证实转染chk2反义寡核苷酸后SKOV3细胞中Chk2蛋白表达受到明显抑制.流式细胞仪检测抑制c

2、hk2基因表达后SKOV3细胞凋亡率为（77.6±1.7）%，明显高于正常组（24.7±1.76）%，空脂质体组（35.6±1.4）%及转染正义寡核苷酸细胞组（47.6±1.2）%.TUNEL法检测结果与流式细胞法一致.结论：chk2可作为卵巢癌增敏治疗的有效靶点.【关键词】chk2基因；反义核酸技术；卵巢肿瘤；顺铂0引言肿瘤细胞的多耐药性已成为恶性肿瘤化疗失败的重要原因［1］，进行化疗增敏或寻找新的治疗手段具有重要意义.细胞周期检测点是增强肿瘤治疗敏感性研究的热点之一［2］.肿瘤的耐药与肿瘤细胞逃避放化疗诱导的肿瘤细胞凋亡有关，因为放化疗作用下可使细胞周期检测点激活，导致细胞周期停滞和细

3、胞的损伤修复，从而使肿瘤细胞避免凋亡.周期检测点激酶1，2（checkpointkinase1，2，Chk1，Chk2）是细胞周期检测点中最关键的效应蛋白酶［3］.国外一些研究表明，转染chk1/chk2反义寡核苷酸可明显提高一些肿瘤模型对抗肿瘤药物的敏感性，说明chk1/chk2可能是一些肿瘤增敏治疗的有效靶点［4］.本研究通过检测chk2反义寡核苷酸对顺铂诱导的SKOV3细胞凋亡的影响，以探讨chk2能否作为卵巢癌增敏治疗的有效靶点.1材料和方法1.1材料SKOV3细胞株由西安交通大学临床医学研究分子中心提供.RPMI1640购自Gibco公司，胎牛血清购自杭州四季青生物工程材料有限

4、公司，噻唑蓝（MTT）购自Amressco公司，转染试剂Lipofectamine2000购自Invitrogen公司，鼠抗人Chk2mAb购自NEOMARKERS公司，辣根酶标记羊抗鼠二抗购自博士德公司，原位细胞凋亡检测试剂盒购自华美生物工程公司.1.2方法61.2.1细胞培养人卵巢癌细胞SKOV3常规培养在含100mL/L胎牛血清的RPMI1640培养基中，培养条件为37℃，50mL/LCO2饱和湿度，待细胞长满瓶底时，2.5g/L胰蛋白酶消化传代.1.2.2MTT法测定不同浓度顺铂在不同时间对SKOV3细胞生长的抑制率取对数生长期的SKOV3细胞，调整细胞密度为5×107/L，

5、接种于96孔板,200μL/孔,37℃，50mL/LCO2培养箱中培养24h后加药，使顺铂终浓度为10，20，40，80，160μmol/L,每个浓度设四个平行孔，并同时设不加药物的阴性对照和无细胞的空白对照，分别于作用24，48，72h后加入20mmol的MTT溶液，20μL/孔，继续培养4h后，吸去上清，加入DMSO，150μL/孔，振荡器震荡10min，使结晶溶解完全，用酶标仪(650BIORAD公司)在490nm处测量A值，计算细胞增殖抑制率（inhibitionrate,IR%）.绘制顺铂对SKOV3细胞的生长抑制曲线.1.2.3脂质体介导寡核苷酸转染SKOV3细胞株1.2.

6、3.1寡核苷酸链的设计和合成根据文献［5］合成chk2的反义寡核苷酸链（antisenseoligodeoxynucleotide，Adosn:5′TCCACAGGCACCACTTCC3′）,并同时合成其正义的寡核苷酸链(oligodeoxynucleotide,odn:5′GGAAGTGGTGCCTGTGGA3′)作为对照.均采用全硫代修饰，其中部分寡核苷酸链的5′端以FITC标记.1.2.3.2实验分组与转染细胞分4组,A：正常组：未经任何处理；B：转染空脂质体组(LP);C：转染chk2正义链组（chk2odn组）；D：转染chk2反义链组（chk2Asodn组）.B至D两组在转

7、染终止10h后同样用40μmol/L顺铂处理细胞24h.1.2.3.3转染效率的测定于转染前一日用无抗生素的含10mL/L胎牛血清的RPMI1640调整细胞密度为2.5×108/L，接种于24孔板，500μL/孔.转染当天细胞密度达到90%~95%，并换为500μL无抗生素无血清RPMI1640培养.分别取不同量的荧光标记的寡核苷酸链(0.6，0.8，1.0μg)加到50μL的RPMI1640中，混匀.