chk2反义寡核苷酸对顺铂诱导卵巢癌skov3细胞凋亡的影响论文

《chk2反义寡核苷酸对顺铂诱导卵巢癌skov3细胞凋亡的影响论文》由会员上传分享，免费在线阅读，更多相关内容在工程资料-天天文库。

1、chk2反义寡核苷酸对顺铂诱导卵巢癌SKOV3细胞凋亡的影响论文朱克修，李玢，王佳，韩晓兵【摘要】目的：观察卵巢癌SKOV3细胞转染chk2反义寡核苷酸后在顺铂作用下细胞凋亡的变化.方法：用MTT法检测不同浓度顺铂对SKOV3细胞的抑制率，ARKERS公司，辣根酶标记羊抗鼠二抗购自博士德公司，原位细胞凋亡检测试剂盒购自华美生物工程公司.1.2方法1.2.1细胞培养人卵巢癌细胞SKOV3常规培养在含100mL/L胎牛血清的RPMI1640培养基中，培养条件为37℃，50mL/LCO2饱和湿度，待细胞长满瓶底时，2.5g/L胰蛋白酶

2、消化传代.1.2.2MTT法测定不同浓度顺铂在不同时间对SKOV3细胞生长的抑制率取对数生长期的SKOV3细胞，调整细胞密度为5×107/L，接种于96孔板,200μL/孔,37℃，50mL/LCO2培养箱中培养24h后加药，使顺铂终浓度为10，20，40，80，160μmol/L,每个浓度设四个平行孔，并同时设不加药物的阴性对照和无细胞的空白对照，分别于作用24，48，72h后加入20mmol的MTT溶液，20μL/孔，继续培养4h后，吸去上清，加入DMSO，150μL/孔，振荡器震荡10min，使结晶溶解完全，用酶标仪(650BI

3、ORAD公司)在490nm处测量A值，计算细胞增殖抑制率（inhibitionrate,IR%）.绘制顺铂对SKOV3细胞的生长抑制曲线.1.2.3脂质体介导寡核苷酸转染SKOV3细胞株1.2.3.1寡核苷酸链的设计和合成根据文献［5］合成chk2的反义寡核苷酸链（antisenseoligodeoxynucleotide，Adosn:5′TCCACAGGCACCACTTCC3′）,并同时合成其正义的寡核苷酸链(oligodeoxynucleotide,odn:5′GGAAGTGGTGCCTGTGGA3′)作为对照.均采用全硫

4、代修饰，其中部分寡核苷酸链的5′端以FITC标记.1.2.3.2实验分组与转染细胞分4组,A：正常组：未经任何处理；B：转染空脂质体组(LP);C：转染chk2正义链组（chk2odn组）；D：转染chk2反义链组（chk2Asodn组）.B至D两组在转染终止10h后同样用40μmol/L顺铂处理细胞24h.1.2.3.3转染效率的测定于转染前一日用无抗生素的含10mL/L胎牛血清的RPMI1640调整细胞密度为2.5×108/L，接种于24孔板，500μL/孔.转染当天细胞密度达到90%~95%，并换为500μL无抗生素无血清RPMI

5、1640培养.分别取不同量的荧光标记的寡核苷酸链(0.6，0.8，1.0μg)加到50μL的RPMI1640中，混匀.再取2μL的Lipofectamine2000，加到50μL的RPMI1640中，混匀.室温放置5min后，将分别混有寡核苷酸链和Lipofectamine2000的RPMI1640混合，室温放置20min（寡核苷酸链与脂质体比值分别为0.6μg∶2μL，0.8μg∶2μL和1.0μg∶2μL）.将上述混合物加入24孔板中，轻轻混匀，放37℃，50mL/LCO2培养箱中，培养6h后将培养基换为500μL含100mL

6、/L胎牛血清的RPMI1640，继续培养至24h，荧光倒置显微镜下观察转染效率.1.2.4期检测点发挥作用［9］.DNA受损后，活化的chkl/2磷酸化CDC25上的Sevr216，使其形成与1433蛋白质结合的位点，从而阻止CDC25的去磷酸化作用.如此cdc2因未脱磷酸化不具活性最终影响cdc2与CyclinB构成的活性复合体从而引起G2M期阻滞［10-11］.卵巢癌细胞对化疗药物的耐药是治疗失败的重要原因.为了证明chk2是否是卵巢癌增敏治疗的有效靶点，通过反义寡核苷酸杂交技术，合成chk2反义寡核苷酸链，经过杂交，用TT法

7、检测不同浓度的顺铂在不同时间点对卵巢癌SKOV3细胞的抑制率的变化.通过本试验，我们了解到顺铂对SKOV3细胞的抑制率随时间和浓度的增加上升.并计算出DDP作用24h的IC50值为37.2μmol/L.所以我们在后面的实验中均选择用40μmol/L顺铂处理SKOV3细胞24小时.并通过检测chk2反义寡核苷酸转染细胞的效率，获得一个最佳的寡核苷酸和脂质体的比例，使实验结果更加稳定可靠.以上结果表明DNA/Lipofectamine2000脂质体比率为0.6μg/2μL,0.8μg/2μL和1.0μg/2μL时的转染效率均接近100%

8、.我们选择寡核苷酸/Lipofectamine2000脂质体比率为0.8μg/2μL来转染SKOV3细胞.转染后，用］.北京：人民卫生出版社，2004：329-333.［2］MeloJ,To