chk2反义寡核苷酸对顺铂作用下hela细胞凋亡的影响

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1、chk2反义寡核苷酸对顺铂作用下HeLa细胞凋亡的影响：朱克修，王佳，李玢，曹亚莉，韩晓兵【摘要】目的观察宫颈癌HeLa细胞转染chk2反义寡核苷酸后，在顺铂作用下对凋亡的影响。方法采用MTT法检测不同浓度顺铂作用人宫颈癌细胞株HeLa24、48、72h后对细胞的生长抑制率。以脂质体为载体将chk2正义链和反义链转染HeLa细胞，用ethodsTheproliferation-inhibitingratesofHeLacellsinducedbyDDPindifferentconcentrationeasu

2、redbyMTTassays.Oligonucleotidee.TheexpressionofChk2eterandTUNEL.ResultsThegroe.Transfectionutant)、ATR-Chk1/2-Cdc25A、Cdc25B、Cdc25C轴组成［1］。细胞周期检测点激酶2(checkpointkinase2,Chk2)属于丝氨酸/苏氨酸激酶,是细胞周期检测中最关键的效应蛋白激酶［2］。因此，以chk2为作用靶点,干扰细胞损伤修复机制,提高肿瘤治疗的敏感性可能成为一种有效的治疗选择。本研究

3、通过检测chk2反义寡核苷酸对顺铂诱导的HeLa细胞凋亡的影响，探讨chk2能否作为宫颈癌增敏治疗的有效靶点。　　1材料与方法　　1.1材料　　人宫颈癌HeLa细胞株由西安交通大学医学院第一附属医院临床研究医学分子中心提供，在37℃，50mL/L的CO2条件下用含100mL/L胎牛血清的RPMI1640培养基培养。RPMI1640购自GIBCO公司，胎牛血清购自杭州四季青生物工程材料有限公司。MTT购自Amressco公司，转染试剂Lipofectamine2000购自美国Invitrogen公司。鼠抗人C

4、hk2单克隆抗体购自Neomarkers公司，辣根酶标记的羊抗鼠抗体购自博士德公司，ECL购自AmershamBioscience公司。AnnexinV-FITC试剂盒购自北京博奥森生物技术有限公司。原位细胞凋亡检测试剂盒购自华美生物公司。　　1.2MTT法检测顺铂(DDP)对细胞的生长抑制率　　取对数生长期的HeLa细胞，调整细胞浓度5×104/mL，接种于96孔板，200μL/孔，培养24h后加药，使顺铂终浓度为10、20、40、80、160μmol/L，每个浓度设四个平行孔，并同时设不加药物的阴性对照

5、和无细胞的空白对照，分别于作用24、48、72h后加入5g/L的MTT溶液，20μL/孔，继续培养4h后，吸去上清，加入二甲基亚砜(DMSO)，150μL/孔，振荡器震荡10min，使结晶溶解完全，用酶标仪在490nm处测量吸光度A值，计算细胞增殖抑制率(inhibitionrate,IR%)。以浓度为横轴，细胞生长抑制率为纵轴绘制在不同时间点不同浓度顺铂对HeLa细胞的生长抑制曲线。　　1.3寡核苷酸的转染　　1.3.1寡核苷酸的合成　　chk2反义寡核苷酸序列参考文献［3-4］，由上海生工生物技术服务有

6、限公司合成，序列为：chk2反义链：5′-TCCACAGGCACCACTTCC-3′；正义链：5′-GGAAGTGGTGCCTGTGGA-3′,采用全硫代修饰，部分寡核苷酸链的5′端以FITC标记。　　1.3.2最佳转染条件的确定和转染效率的检测　　严格按照Lipofectamine2000试剂说明书进行转染，具体如下：于转染前一天用无抗生素的含100mL/L胎牛血清的RPMI-1640调整细胞浓度为2.5×105/mL，接种于24孔板，500μL/孔。转染当天细胞密度达到90%-95%，并换为500μL无

7、抗生素无血清RPMI-1640。分别取不同量的荧光标记的寡核苷酸链(0.6、0.8、1.0μg)加到50μL的RPMI-1640中，混匀。再取2μL的Lipofectamine2000，加到50μL的RPMI-1640中，混匀。室温放置5min后，将分别混有寡核苷酸链和Lipofectamine2000的RPMI-1640混合，室温放置20min(寡核苷酸链与脂质体比值分别为0.3、0.4、0.5μg/μL)。将上述混合物加入24孔板中，轻轻混匀，培养6h后将培养基换为500μL含100mL/L胎牛血清的R

8、PMI-1640，继续培养至24h，荧光倒置显微镜下观察转染效率。　　1.3.3in使蛋白变性，12g/L的SDS-PAGE电泳分离后，湿转到硝酸纤维素膜上，将膜置于50g/L脱脂奶粉中室温封闭1h，以鼠抗人的Chk2单克隆抗体按1∶400室温孵育1.5h，用TBST洗膜6次，每次3min，再与辣根酶标记的羊抗鼠二抗1∶500室温孵育1h，TBST洗膜6次，每次3min，以ECL显色，X光胶片曝光，洗片。用凝胶成