bfgf与egf诱导bmscs向神经干细胞分化的观察

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1、bFGF与EGF诱导BMSCs向神经干细胞分化的观察：伦鹏孟庆海刘广义【关键词】bFGF［摘要］目的探讨碱性成纤维细胞生长因子（bFGF）、表皮生长因子（EGF）在体外条件下对骨髓基质干细胞（BMSCs）向神经干细胞（NSCs）和神经样细胞分化的诱导作用。方法采用出生4周左右大鼠的全骨髓细胞进行培养，传至第3代时，分为两组:实验组细胞加入bFGF和EGF，进行诱导分化；对照组不加因子继续培养。在倒置显微镜下每日观察、记录BMSCs的诱导分化情况，并应用免疫组化技术对细胞进行兔抗巢蛋白（Nestin）单抗、兔抗神

2、经元特异性烯醇化酶（NSE）单抗、兔抗胶质纤维酸性蛋白（GFAP）单抗鉴定。结果实验组诱导7d后有部分细胞具备神经元样细胞形态，胞体锥形或圆形，有较长单极或多极的突起，均有Nestin、NSE、GFAP阳性细胞表达，且3种细胞数量差别有显著性（t=3.266~6.099,P<0.05）。而对照组细胞仍为典型的成纤维细胞形态，无Nestin、NSE、GFAP阳性细胞。结论bFGF、EGF可以诱导BMSCs向NSCs分化，并可调控神经元分化，促进神经元细胞成熟。［关键词］骨髓细胞;干细胞;成纤维细胞生长因子;

3、表皮生长因子;巢蛋白［ABSTRACT］ObjectiveTostudyarroalcells(BMSCs)couldbeinducedtodifferentiateintoneuralstemcells(NSCs)andneuronsbybasicfibroblastgroalgroarroalcellsbonemarroicroscopemunohistochemistrytechniqueeBMSCsappearedtypicalmorphologicalneuronaltraits:therefract

4、ileandconelikeorsphericalcellbodiesandlongprocesses,expressedNestinorNSEorGFAP.Thethreekindsofcellsshoightregulatethedifferentiationandpromotethematurationofneurons.［KEYEM/F12培养液反复冲洗骨髓腔，冲洗液收集于无菌离心管中，得到细胞悬液1000r/min离心3min。弃去上清液，加入体积分数0.10血清培养液，充分吹打至单细胞悬液，调细胞浓

5、度为4×108/L,接种于培养瓶中。置于37℃、体积分数0.05CO2培养箱中培养。48h后全量换液，去除未贴壁细胞。以后每3~4d换液一次，待细胞长至80％~90％融合后，用含0.2g/LEDTA及0.25g/L胰酶的消化液消化，以细胞密度4×108/L接种传代。1.3诱导和分化传至第3代时，分为实验组和对照组。实验组加入bFGF、EGF（终质量浓度200ng/L）培养。对照组不加bFGF、EGF，用原培养液继续培养。每日观察、记录细胞生长情况。1.4细胞免疫组化染色及观察bFGF、EGF诱导培养后第6天，调

6、细胞浓度为4×108/L，分别将两组细胞接种入24孔培养板，每孔0.5mL，贴壁24h后，40g/L多聚甲醛固定，分别进行Nestin、NSE、GFAP免疫组化鉴定，DAB显色，倒置显微镜下拍照记录，细胞浆呈棕黄色者为阳性细胞。SABC法鉴定细胞成分：一抗分别为Nestin单抗、NSE单抗、GFAP单抗；二抗为羊抗兔或鼠IgG，以确定诱导分化的细胞是否为神经元和胶质细胞。DAB显色法染色，着棕黄色的细胞判定为阳性。阳性对照为星形细胞瘤和神经元肿瘤，阴性对照孔不加一抗。倒置光学显微镜下观察。高倍镜（400倍）下，

7、在每孔的中心和四周随机选择5个视野，进行细胞计数，结果以±s表示，数据间比较采用t检验。2结果2.1BMSCs的形态BMSCs培养24h后可见细胞贴壁，但混杂有大量红细胞。48h换液后可除去红细胞，其余贴壁细胞于3~4d后进入对数增长期，细胞呈集落样生长，形成多个克隆团样结构，10d左右达到80％~90％融合。倒置显微镜下观察，细胞主要有两种形态：下层为梭形和多角形的成纤维细胞，体积较大，约占90％左右；另有较少的小圆形的多形细胞，折光率较高。3讨论bFGF是一种广谱的神经营养因子，胚胎期脑内的含量很高［2］。

8、EGF在发育脑和成年脑内均有表达，神经元和星形胶质细胞均可表达EGF。有实验证实，bFGF能促进神经元前体细胞的存活或使NSCs向神经元前体细胞分化增殖，从而导致NSCs分化为神经元的比例增多［3］，而EGF则主要刺激胶质前体细胞增殖［4］。但体外实验证实，EGF能促使NSCs存活和增殖，且EGF在NSCs增殖后期发挥作用［5］。bFGF和EGF不只是起到有丝分裂原的作用，也可促进细胞