EGF和bFGF联合诱导人脐血MSCs向神经细胞分化过程中的端粒酶活性变化

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1、郑州大学2004届硕士研究生学位论文EGF和bFGF联合诱导人脐血MSCs向神经细胞分化过程中的端粒酶活性变化EGF和bFGF联合诱导人脐血MSCs向神经细胞分化过程中的端粒酶活性变化研究生龚光明导师陈宗德曹孟德郑州大学基础医学院微生物学与免疫学教研室郑州450052摘要神经干细胞具有自我更新能力和多分化潜能，可分化为神经元、星形胶质细胞和少突胶质细胞等主要类型的神经细胞。虽然脑组织中存在这种具有持续分裂潜能的神经干细胞，但由于其数量少并缺乏足够的正向刺激信号，在损伤条件下无法产生大量新生细胞；存在于成年脑组织内的神经干细胞取材困难；从胚胎干细胞诱导分化而来或直

2、接从胎脑组织中分离而来的神经干细胞又涉及伦理及免疫排斥反应等问题，严重限制了神经干细胞的临床应用。因此，寻找新的神经干细胞的来源对于神经科学领域基础与临床应用研究的发展有着重要意义。l旬充质干细胞(mesenchymalstemcells，MSCs)不仅能够跨胚层向多种组织和细胞类型分化，并且在体外易于分离培养和扩增。这些特性使MSCs成为在细胞治疗、基因治疗中有效发挥作用的理想工程细胞。国内外已有较多实验证明骨髓来源的MSCs(bonemesenchymalstemcells，BMSCs)在体外可以分化为神经细胞。MSCs不仅存在于骨髓，也存在于脐血和外周血中

3、。近期的研究表明脐血MSCs具有与骨髓MSCs相似的分化为神经细胞的功能。端粒酶的适度低表达是脐血MSCs维持增殖能力的必要条件之一，端粒酶活性的高低可间接反映脐血MSCs的增殖能力和移植的安全性(无致瘤性)。本研究对重组人表皮生长[]-子(epitheliumgrowthfactor,EGF)Nl碱性成纤维生长因子(basicfibroblastgrowthfactor，bFGF)联合诱导人脐血MSCs体外向神经细胞分化过程中端郑卅太学2004届硕士研究生学位论文EGF和bFGF联合诱导人脐血MSCs向神经组瞻分化过程生堕堕塾壁亟堡!堕粒酶活性变化进行检测，以

4、探讨人脐血MSCs体外向神经细胞分化过程中的增殖性和安全性，为其临床应用提供实验和理论依据。方法：采集健康自然分娩产妇志愿捐献的脐血，用PBS(pH7．4)进行l：1稀释，密度梯度离心分离单个核细胞(mononuclearcells，MNCs)，PBS洗涤2次后重悬于含20％胎牛血清的DMEM／F12中，苔盼蓝染色计数，调整细胞数后，接种于T一75培养瓶内(细胞密度为l×106／m1)，一组不加细胞因子，另一组加入EGF和bFGF，终浓度各为10ng／ml，剩余细胞用液氮冻存。培养24h倾去全部液体以去除未贴壁细胞，以后每3d全量换液一次，倒置显微镜下观察细胞形

5、态变化。分别收集培养ld、4d、7d、10d、14d、21d的贴壁细胞和冻存细胞，PBS洗涤后计数活细胞，将细胞密度调整一致，采用反转录多聚酶链反应(reverse-transcriptpolymerasechainreaction，RT-PCR)方法检测脐血MSCs培养前后各时间段的巢蛋白(nestin)、神经丝亚单位M(neurofilamentsubunitM，NF．M)和人端粒酶逆转录酶(humantelomerasereversetranscriptase，hTERT)mRNA表达；采用端粒重复序列扩增法(telomererepeatamplifica

6、tionprotocalassay，TRAP)一酶联免疫吸附实验(ELISA)法检测人脐血MSCs向神经细胞分化过程中的端粒酶活性变化。结果：1．RT-PCR检测发现，未培养的脐血细胞nestin、NF．M、hTERTmRNA均表达阳性。培养后nestin、hTERTmRNA二者表达随培养时间延长而下降，至第7d已不能检出；而NF—MmRNA的表达随培养时间延长而增强。细胞因子组与对照组相比，细胞因子能促进NF．MmRNA的表达，能延缓nestin、hTERTmRNA表达的下降趋势。2．TRAP(PCR)-ELISA法检测发现，未培养的脐血细胞端粒酶活性较高，以

7、后随培养时间的延长而下降(P

8、治疗神经系统疾病提供了安