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《bmscs条件培养基对神经干细胞增殖与分化的影响》由会员上传分享，免费在线阅读，更多相关内容在工程资料-天天文库。
1、BMSCs条件培养基对神经干细胞增殖与分化的影响 神经干细胞（neuralstemcells,NSCs）是一类分布于神经系统，具有自我更新并拥有多向分化潜能的干细胞，其主要分化为星形胶质细胞、神经元细胞及少突胶质细胞，替代受损的神经组织从而起到治疗脊髓损伤的作用[1-2].骨髓间充质干细胞（bonemarroesenchymalstemcells,BMSCs）属于成体干细胞的一种，不仅具有成骨、成脂等多向分化潜能，还能分泌多种神经营养因子[3],近年来利用BMSCs与NSCs共培养技术治疗脊髓损伤已成为研究热点。有报道[4]指出，BMSCs与NSCs共移植治疗神经损伤
2、疗效优于单纯移植NSCs,说明BMSCs为NSCs的生长与分化提供了一个更加合适的微环境。 然而，是BMSCs本身还是其分泌的营养因子发挥了作用仍值得探讨。该研究利用富含营养因子的BMSCs条件培养基体外培养NSCs,去除BMSCs本身的影响，能够充分了解BMSCs条件培养基对NSCs增殖与分化的影响，为BMSCs条件培养基的应用提供实验依据。 1材料与方法 1.1材料 1.1.1实验动物新生24h内SD大鼠1只，雌雄不限；4~5周龄SD大鼠1只，100~120g,购自安徽医科大学实验动物中心。 1.1.2实验试剂及仪器DMEM/F12培养基（美国Gibco公
3、司）；DMEM低糖、南美胎牛血清（美国HyClone公司）;B-27（美国Invitrogen公司）；表皮生长因子（epidermalgroicrotubule-associatedprotein-2,MAP-2）（美国SantaCruz公司）；小鼠抗大鼠髓鞘碱性蛋白（myelinbasicprotein,MBP）（英国Abcam公司）；FITC标记的山羊抗小鼠IgG、TRITC标记的山羊抗兔IgG、TritonX-100（北京中杉金桥生物技术有限公司）；CD29-PE、CD90-PE、CD34-FITC、CD44-FITC（美国BioLegend公司）；多聚赖氨酸（美
4、国Sigma公司）；MTT试剂盒、胰酶、免疫荧光稀释液、多聚甲醛、Hoechst33342、青链霉素（100）（上海碧云天生物技术有限公司）；山羊血清（中国武汉博士德公司）；ECL显示试剂盒（美国Pierce公司）；CO2恒温培养箱（美国SHELLAB）；倒置显微镜CKX41（日本Olympus公司）；流式细胞仪（美国BDFACSVerseTM）；荧光显微镜DMI6000型（德国Leica公司）。 1.2方法 1.2.1大鼠BMSCs体外分离、培养、鉴定采用本课题组前期的实验方法[5]从大鼠骨髓中分离并培养出BMSCs,取生长良好的第3代BMSCs,胰酶消化后制成单
5、细胞悬液，计数，参照之前的方法，行细胞表面标记CD90、CD34、CD29的流式细胞仪检测。 1.2.2大鼠BMSCs条件培养基的制备取第3代生长良好的BMSCs,待细胞长至约90%密度时，弃去原培养基，PBS洗涤3次，每次5min;加入DMEM/F12培养基继续培养48h后，收集浓缩上清液，按前期实验比例配制成NSCs增殖与分化条件培养基。 1.2.3大鼠NSCs的分离、培养、鉴定取新生24hSD大鼠幼鼠，处死后置于75%酒精浸泡5min;在无菌条件下分离出大脑半球，剪碎，加入0.25%胰酶消化10min,轻轻吹打混匀后经筛X过滤成单细胞悬液；加入增殖培养基（DM
6、EM/F12+2%B27+20ng/mlbFGF+20ng/mlEGF+链霉素0.1mg/ml+青霉素100U/ml），600r/min离心5min2次，弃上清液；吹打混匀后以3105/ml接种于培养瓶中，置于37℃、5%CO2培养箱中培养，每3d半定量换液1次，培养7d后传代。 取第2代培养7d的细胞球，600r/min离心5min,弃上清液，接种于经0.1mg/ml多聚赖氨酸包被盖玻片的6孔板中，置于37℃培养箱6h,使悬浮干细胞贴壁。用PBS洗涤3次，每次5min;4%多聚甲醛固定后，PBS洗涤3次，每次5min.在含0.3%TritonX-100中孵育10mi
7、n,PBS洗3次后，加入正常山羊血清封闭液，置于37℃细胞培养箱内孵育1h后，加入1∶50稀释Nestin一抗，4℃条件下孵育过夜。次日常温下放置2h,PBS洗涤3次，每次5min,加入1100稀释FITC标记的山羊抗小鼠IgG,37℃细胞培养箱内避光孵育1h.最后行Hoechst溶液核染后封片，荧光显微镜下观察、拍照。 1.2.4大鼠NSCs分化及分化后鉴定取第2代培养7d的NSCs球，600r/min离心5min,弃上清液；加入分化培养基（DMEM/F12+2%B27+链霉素0.1mg/ml+青霉素100U/ml+10%FBS），吹
