pdgf与vegf联合诱导人bmscs向软骨细胞分化的实验研究

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1、分类号R6密级公开UDC684.3硕士学位论文PDGF与VEGF联合诱导人BMSCs向软骨细胞分化的实验研究学位申请人：谢辉晋学科专业：外科学指导教师：杜远立教授二○一二年五月ADissertationSubmittedinPartialFulfillmentoftheRequirementsfortheDegreeofMasterofMedicineEffectsofPDGFandVEGFininducingchondrogenesisofbonemarrowstemcells:anin-vitroresearchGraduateStud

2、ent:XieHuijinMajor:SurgerySupervisor:Prof.DuYuanliChinaThreeGorgesUniversityYichang,443002,P.R.ChinaMay,2012三峡大学硕士学位论文三峡大学学位论文原创性声明本人郑重声明：所呈交的学位论文，是本人在导师的指导下，独立进行研究工作所取得的成果，除文中已经注明引用的内容外，本论文不含任何其他个人或集体已经发表或撰写过的作品成果。对本文的研究做出重要贡献的个人和集体均已在文中以明确方式标明，本人完全意识到本声明的法律后果由本人承担。学位论文作者

3、签名：日期：三峡大学研究生知识产权承诺书本人承认：我作为三峡大学硕士研究生在校学习期间，在导师指导下，依据研究工作所作学位论文的知识产权全部权归三峡大学所有。本人承诺：我有义务维护三峡大学的知识产权，凡是以我本人学位论文内的全部或部分研究成果，或实验数据为基础所形成的研究论文及成果，无论是以何种形式刊发学术论文、进行成果鉴定或申报奖励，均以三峡大学为第一作者单位或完成单位，并事先征得导师或学校相关部门的同意。我愿承担因违背上述承诺而引起的一切法津和经济后果。学位论文作者签名：日期：I三峡大学硕士学位论文内容摘要目的：本实验旨在建立体外分离、

4、培养BMSCs的方法，拟验证在血管内皮生长因子与血小板衍生生长因子联合作用下，BMSCs向软骨细胞转化是否优于单独使用细胞因子。为软骨组织工程提供更多的实验依据，为人工软骨的临床运用打下坚实的理论基础。方法：采用密度梯度离心法结合贴壁筛选法分离人体股骨干骨髓中的BMSCs，经体外扩增培养、流式细胞仪鉴定细胞表面抗原后，取第4代细胞在单层培养条件下，按空白组、PDGF组、VEGF组，PDGF+VEGF组，采用MTT法测各组BMSCs增殖情况，再进行向软骨方向的诱导培养。在诱导的第28天采用阿利新蓝—HE染色法观察各组细胞形态，用阿利新蓝比色法

5、测GAG含量，用RT-PCR法检测Ⅱ型胶原mRNA量，用westernblot法测Ⅱ型胶原表达水平。结果：采用密度梯度离心法结合贴壁筛选法分离出的细胞符合BMSCs形态特征，流式细胞仪检测结果为：CD34、CD45为阴性，CD44、CD90、CD29为阳性，符合BMSCs表面抗原表达特性。MTT法检测结果示：在24h、48h、72h三个时间段，PDGF组、VEGF组、PDGF+VEGF组的OD值均明显高于空白组，且P<0.05，差异有统计学意义；PDGF组、VEGF组的OD值均明显高于VEGF+PDGF组，P<0.05，差异有统计学意义。诱

6、导至28天时采用阿利新蓝——HE复染色，各组均可见均匀蓝染的细胞外基质，基质中可见明显的软骨陷窝，陷窝内可观察到类软骨结构，空白组的细胞外基质相对其他组蓝染较淡，软骨陷窝数量较其他组少。PDGF+VEGF组的细胞外基质相对其他组蓝染最深，软骨陷窝数量高于其他各组，且胞核清晰、触角明显。PDGF组与VEGF组爬片相比较，未见明显差异。阿尔新蓝法测定培养液中GAG的含量结果为：空白组：55.40±2.31mg/L，PDGF组：65.81±1.56mg/L，VEGF组：67.66±1.49mg/L，VEGF+PDG组：89.33±0.83mg/L

7、，PDGF组、VEGF组、PDGF+VEGF组的GAG含量均高于空白组，且P<0.05，差异有统计学意义。VEGF+PDGF组的值要高于PDGF组、VEGF组，P<0.05，差异有统计学意义。RT-PCR法检测Ⅱ型胶原mRNA水平显示：PDGF组、VEGF组、PDGF+VEGF组的半定量值均高于空白组，且P<0.05，差异有统计学意义。VEGF+PDGF组的值要高于PDGF组、VEGF组，P<0.05，差异有统计学意义。Westernblot法检测Ⅱ型胶原蛋白表达水平显示：PDGF组、VEGF组、PDGF+VEGF组的半定量值均高于空白组，

8、且P<0.05，差异有统计学意义。VEGF+PDGF组的值要高于PDGF组、VEGF组，P<0.05，差异有统计学意义。结论：密度梯度离心法结合贴壁筛选法分离出的骨髓间充质干细胞