人脐带间充质干细胞向软骨细胞诱导分化的实验研究

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1、山西医科大学硕士学位论文人脐带间充质干细胞向软骨细胞诱导分化的实验研究姓名：祝佳佳申请学位级别：硕士专业：骨科学指导教师：卫小春20070504一出疆医赴盘芏曼±兰壁曼塞人脐带闻充质千细胞向软骨细胞诱导分化的实验研究摘要目的探讨人脐带问充质干细胞在单层培养中向软骨细胞定向分化的条件，为软骨组织工程学提供新的种子细胞．方法采用细胞产品国家工程研究中心原代人脐带问充质干细胞，在含10％胎牛血清的低糖DMEM／F-12培养液中培养扩增，流式细胞仪分析脐带问充质干细胞的表面标志。将培养第3代细胞分为4组：A组为对照组，

2、B组为无血清诱导培养基组(含lOng／ml的TGF-口l、丙酮酸钠lmM、地塞米松10-7M、牛胰岛素6．25l,g／mt、转铁蛋白6．25ag／ml的高糖DMEM培养液)；c组为含5％胎牛血清的诱导培养基组；D组为含10％胎牛血清的诱导培养基组。倒置显微镜下观察细胞生长状况，甲苯胺蓝染色检测蛋白多糖的分泌，免疫组化检测Ⅱ型胶原分泌，原位杂交检测Ⅱ型胶原mRNA表达，MTT法检测细胞的增殖情况．结果脐带问充质干细胞经体外培养扩增，贴壁后的细胞形态均一，呈梭形，并一致表达CD44，而CD34、CD38呈阴性．B、

3、c组细胞在诱导培养9天后甲苯胺蓝染色阳性，Ⅱ型胶原免疫组化均为阳性，原位杂交可检测到Ⅱ型胶原mRNA的表达，而A、D两组分别为阴性和弱阳性．D组细胞增殖最强，而B组细胞最弱，四组细胞经MT'F法检测后吸光度值(opticaldensityOD)大小顺序为D>C>A>B。结论人脐带间充质干细胞在体外培养扩增后，生长稳定，表型均一；10ng／ml的TGF-15l可诱导人脐带间充质干细胞向软骨细胞方向分化，但在无血清培养基中无法有效的促进细胞的增殖；低浓度的胎牛血清(5％)和10rig／ram的TGF-pl联合作用既

4、可促进入脐带问充质干细胞的增殖，又可诱导其向软骨细胞方向分化，而高浓度胎牛血清仅对细胞的增殖有促进作用．．关键词脐带，问充质干细胞，转化生长因子p1，分化，软骨细胞ExperimentalStudyofInVitroChondrogenicDifferentiationofHumanumbilicalcordMesenchymaiStemCellsAbstactPurposeThepurposeofthisstudyistoestablishamethodofculturinghumanumbilicalcor

5、dmeseaehymalstemceII(hUCMSC)andinvestigatethefeasibilityofinvitrochondrogenicdifferentiationofhUCMSCinmonolayeralIntreaspotentialseedingcellsincartilagetissueengineering．MethodsTheo堍inalhUCMSCderivedfromTheNationResearchCenterofCellProduction,hUCMSCculturedi

6、ntheDulbccco'sModifiedEagle'sMedium／F-12NutrientMixture(DM：EM，F．12)withlowglucosecontaining10％fetalbovineserum,flowcytometricanalysisWasperformedtoexaminetheexpressionofcellsurfacemoleculesOUhUCMSC．HUCMSC丘omthethirdpassageweregrownincompletemedium(A)，inducti

7、veserum-freemedium(B)，inductivemediumwith5％fetalbovinesemm(q，inductivemediumwith10％fetalbovinescram(D)respectively．ThegrowthoftheculturedhUCMSCWasobserved．Tbesyntheticproteoglycamweredetectedbytoluidinebluestaining．Immunohistochemistryandinsituhybridizationw

8、ereappliedtodetecttheexpressionofcollagentypeII．11虻proliferationofthecellswasexaminedbyMTTtesLResultsAfterproliferationinvitro．Tbeadherentcellsshowedaspindle—likeappearanceandexpressedpositiveCD