黄连素体外诱导人脐带间充质干细胞向神经样细胞分化

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1、目录中文摘要⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯l英文摘要⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯4研究论文黄连素体外诱导人脐带间充质干细胞向神经样细胞分化前言⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯8日U舌⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯8材料与方法⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯．．9结果⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯15附图⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯18附表⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯．．31讨论⋯⋯⋯

2、⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯34结论⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯．37参考文献⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯．．⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯．38综述中药诱导间充质干细胞向神经样细胞分化的研究⋯⋯⋯⋯⋯43致谢⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯54个人简历⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯55中文摘要黄连素体外诱导人脐带间充质干细胞向神经样细胞分化摘要目的：对分离培养的人脐带间充质干细胞(humanumbilicalcordmesenchymalstemcells，hUMSCs)生

3、物学特性进行鉴定，探讨黄连素在体外定向诱导hUMSCs向神经细胞分化中的作用和条件，为定向诱导hUMSCs向神经分化以及在临床上的应用提供理论支持和实验基础。方法：取足月剖宫产健康新生儿脐带，用D．Hank’S充分冲洗，剔除脐动脉、脐静脉，将所剩的脐带间质组织用组织剪切成1mm3大小的组织块，0．2％胶原酶II消化，在含20％胎牛血清(FBS)、2ng／ml表皮细胞生长因子(EGF)、25mM左旋谷氨酰胺(L—Glu)、100U／ml青霉素、100斗g／ml链霉素的DMEM／F12中培养。观察提取的原代细胞的生长状况，当细胞融合至80％"--'90％

4、密度时，加入0．25％胰酶一lmMEDTA进行消化，并传代。采用流式细胞术对首次消化后收集的细胞表型进行检测，包括CDllb、CDl9、CD34、CD45、CD73、CD90、CDl05和组织相容性抗原肌A．DR(MHC．II)，以抗鼠IgGl一PE和IgGl一FITC作为同型对照。原代hUMSCs按比例1：1传代后记作P1代，倒置显微镜下观察细胞形态变化及生长速度，细胞融合达到90％以上时按1：2或1：3比例传代，绘制细胞生长曲线。取生长状态良好P4代的hUMSCs，分为五组：200斗g／ml组、100I，tg／ml组、50pg／ml组、25l-t

5、g／rnl组和对照组。以3x104／孑L的密度接种于5个多聚赖氨酸包被的六孔板中(每个六孔板为一组)，待细胞融合达到70—80％时，实验组的四个六孔板分别换为含有200I．tg／ml、1001xg／ml、50I．tg／ml、251ag／ml黄连素的无血清低糖DMEM／F12培养基的诱导液；对照组六孔板除不加黄连素外，其余均同实验组。倒置显微镜下动态观察细胞形态变化，每12小时一次，连续观察7天，每24h对各组细胞进行免疫细胞化学染色，检测其神经元标志(NSE)、星形胶质细胞标志(GFAP)和神经干细胞标志(Nestin)的表达情况。各组随机选取10个

6、高倍视野，拍照记录计数阳性细胞数及细胞总数，用以计算分化率，结果用均数士标准差来表中文摘要示。分析不同浓度黄连素诱导hUMSCs的分化率。结果：原代细胞消化、传代12h后，大部分细胞贴壁，细胞呈三角形、菱形、椭圆形、圆点等形态；随培养时间延长，细胞逐渐变成均一的长梭形，数量增多。培养7．8d时细胞融合可达80％．90％，低倍镜下看到n删SCs呈放射状、漩涡状排列。按照1：2的比例再传代，连续传至P15代，hUMSCs仍保持旺盛的增殖能力。流式细胞术检测P3、P5和P10代细胞表面分子标记，结果显示各代均表达CD73、CD90和CDl05，而不表达CD

7、llb、CDl9、CD34、CD45和HLA—DR。加入黄连素诱导液后24h，20099／ml组和100陷／ml组有个别细胞开始发生形态改变，光学显微镜下可见：胞体收缩变圆，折光度增强，伸出指状突起；501ag／ml组、25}tg／ml组细胞形态未见明显改变。随着诱导时间延长，细胞胞体进一步收缩，突起增长。36h后部分细胞出现双极突起，以2001xg／ml组变化最为明显。48h后200删、10099／ml组细胞突起较前更加细长，并可多达2至5条，有的细胞突起逐渐发展成多级，并彼此接触交叉，呈神经样网络样结构；此时，501xg／ml组亦可见到少量细胞胞

8、体收缩、指状突起形成；2599／ml组则未见明显变化。60h后20099／ml、1001xg／ml组内相临细