hgf及egf体外诱导vegf165基因修饰bmscs向肝细胞分化的研究

《hgf及egf体外诱导vegf165基因修饰bmscs向肝细胞分化的研究》由会员上传分享，免费在线阅读，更多相关内容在学术论文-天天文库。

1、分类号VDC博士学位论文编号HGF及EGF体外诱导VEGFl65基因修饰BMSCs向肝细胞分化的研究VEGFl6sExpressingBoneMarrowMesenchymalStemCellsDifferentiateintoHepatocytesUnderHGFandEGFInductioninvitro作者姓名：学科专业：指导老师：学院(系、所)：谭艳影像医学与核医学肖恩华湘雅二医院答辩委员会主席中南大学二零一二年三月一令一一，平二月原创性声明本文声明，所呈交的学位论文是本人在导师指导下进行的研究工作及取得的研究成果。尽我所知，除了论文中特别加以标注和致谢的地方外，论文中不包

2、含其他人已经发表中撰写过的研究成果，也不包含为获得中南或其他单位的学位或证书而使用过的材料。与我共同工作的同志对本研究所作的贡献均已在论文中作了明确的说明。作者：日期：盈堕年五月掣日关于学位论文使用授权说明本文了解中南大学有关保留、使用学位论文的规定，即：学校有权保留学位论文，允许学位论文被查阅和借阅；学校可以公布学位论文的全部或部分内容，可以采用复印、缩印或其它手段保存学位论文；学校可根据国家或湖南省有关部门规定送交学位论文。日期：垄堕年互月丑日博士学位论文中文摘要第一章骨髓间充质干细胞的培养、生物学鉴定及VEGF．髓质粒的扩增目的：1．建立兔骨髓基质细胞(BMSCs)体外分离、

3、培养、增殖、冻存的方法，以及探讨其生物学特性。2．VEGF。髓一pCMv6一AC—GFP质粒的扩增及鉴定。方法：采用密度梯度离心法结合贴壁培养法分离纯化、扩增BMSCs，用流式细胞学及免疫细胞化学鉴定BMSCs，光学显微镜及扫描电镜观察BMSCs的细胞形态及生长特性，测定第1、3、5代BMSCs及lo％、15％、25％FBS培养第3代BMSCs的生长曲线。BMSCs在IO％DMSO条件下经液氮或-60。C冻存复苏，测其成活率及增殖能力。VEGF。酷一pCMv6_AC-GFP质粒转化大肠杆菌并扩增、抽提，检测浓度及纯度。结果：BMSCs为贴壁生长，呈均一的梭形成纤维细胞样，流式细胞学

4、显示BMSCs明显表达CD29(93．41％±3．2％，n-3)和CD44(91．55％±4．1％)，而不表达CD45(3．95％±2．9％)和CD34(3．36％±3．．6％)，免疫细胞化学显示CD29和CD44表达阳性，CD45和CD34呈阴性。BMSCs生长曲线呈S型，l-3d为潜伏期，生长较慢；3d后进入对数生长期，步入快速增长；7-8d为平台期，细胞增殖速度趋于平缓。以15％FBS及第1代BMSCs生长状态最佳。BMSCs复苏后细胞活力达90％以上，其生长形态与冻存前无明显差异，可用于后续试验研究。提取的VEGF。∞一pCMV6-AC—GFP质粒的纯度、浓度分别为1．83

5、，0．75ug／ul，可应用于细胞转染试验研究。结论：1．采用密度梯度离心法结合贴壁培养法分离纯化、扩增BMSCs可行。2．兔BMSCs增殖能力强，易体外分离、纯化、扩增，传代的BMSCs可保持其原有的生物学特性。3．冻存后复苏的BMSCs仍有较强的增殖能博士学位论文中文摘要力。4．成功扩增高纯度的VEGF．pCMV6一AC—GFP质粒。关键词：兔，BMSCs，生长曲线，冻存，VEGF嫡质粒第二章构建vEGF。髓_pC肼6-AC—GFP基因修饰的BMSCs目的：比较脂质体2000及电穿孔两种转染方法，为BMSCs基因转染提供可行方案，并建立最佳的转染条件。方法：1．体外分离、扩增兔

6、BMSCs，分别用脂质体2000、电穿孔转染第3代BMSCs，用显微镜观察细胞形态学变化及GFP荧光表达，绘制生长曲‘线观察细胞的增殖能力，用细胞流式法比较两种方法的转染效率。2．选择可行方案并优化转染参数，通过选择不同的电穿孔缓冲液(Opti-DMEM，含血清全培养基及D-Hanks液)，选择不同的电压(250V，280V，310V)，不同的质粒量(20ug，50ug,70ug)的条件下进行电转，用显微镜观察细胞形态学变化及GFP荧光表达，用细胞流式法比较两种方法的转染效率。3．以最优转染参数电转BMSCs后，用200ug／mlG418筛选电转后48h的BMSCs，用RT_PCR

7、检测BMSCs电转后不同时间点VEGF。衢的表达情况。用单因素方差分析所得数据，以a=O．05为检验水准。结果：脂质体2000转染后BMSCs的GFP荧光数稀少，电穿孔转染的GFP荧光数较多，转染效率分别为5．12％、17．3％。脂质体2000转染后BMSCs生长曲线呈水平下降型，细胞几乎没有增殖，后期细胞逐渐死亡，电穿孔转染后BMSCs生长曲线仍呈S型。Opti—DMEM，含血清DMEM及D-Hanks液电穿孔转染效率分别是15．27％，10．53％，13．9i％。