2,3吲哚醌诱导人神经母细胞瘤细胞凋亡作用及机制

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1、2,3吲哚醌诱导人神经母细胞瘤细胞凋亡作用及机制【摘要】目的观察2,3吲哚醌（ISA）经Caspase3途径诱导人神经母细胞瘤凋亡的作用及机制。方法以不同浓度ISA（0、100、200、400μmol/L）作用于SHSY5Y细胞48h，采用Hocehst33258/PI荧光染色技术观察细胞凋亡的形态学改变，流式细胞术检测细胞凋亡率的变化，)andHochest33258/PIstaining,andtheactivityofcaspase3determinedbyFCM.SO溶解，母液浓度为5mmol/L,4℃保存，实验时用无血清培养基稀释至实验浓度（DMS

2、O的体积分数<0.01%）。脱氧核糖核酸酶抑制剂（ICAD）和βactin的抗体购自北京博奥森公司；ECL发光试剂购于北京普利莱公司；藻红蛋白（PE）结合的单克隆活化的Caspase3抗体凋亡试剂盒(PEconjugatedmonoclonalactiveCaspase3antibodyapoptosisKIT)购自BDPharMingen公司；Hochest33258、碘化丙啶(PI)购自美国Sigma公司。　　1.2细胞株及其培养SHSY5Y细胞株购自中国协和基础学院细胞中心，用含体积分数0.15胎牛血清（杭州四季青生物公司）的HDMEM培养基

3、(GIBCO公司产品)，在含体积分数0.05CO2、37℃饱和湿度条件下培养。　　1.3荧光染色取对数生长期的SHSY5Y细胞，以107/L的密度接种于培养瓶中，培养24h后，加入ISA，随机分为对照组（不含ISA）及不同浓度的ISA处理组（100、200、400μmol/L），收集细胞于1.5mL的EP管中,用冷的PBS漂洗2次，离心去上清后，每管中均加入Hochest33258、PI染液使其终浓度分别为40mg/L和50mg/L，37℃避光孵育30min，取出细胞悬液20μL滴于载玻片上，盖上盖玻片，紫外线激发，进行拍照。实验重复3次。　　1.4PI染色、流式

4、细胞仪检测细胞凋亡率的变化收集对照组（不含ISA）及不同浓度（100、200、400μmol/L）ISA处理组细胞，PBS洗涤2次后，PBS重悬，缓慢注入预冷的体积分数0.70乙醇中，30℃固定24h以上，1000r/min离心5min，去除乙醇，PBS清洗1次，离心弃去PBS，加50mg/LPI(含10mg/LRNaseA)0.5mL于避光处染色30min，用流式细胞仪进行检测。实验重复3次。用亚G1期的细胞比率表示细胞凋亡率。　　1.5流式细胞术检测表达活化的Caspase3细胞4℃收集对照组（不含ISA）及不同浓度（100、200、400μmol/L）ISA

5、处理组细胞，PBS洗涤2次后，PBS重悬，逐滴注入预冷的40g/L多聚甲醛中固定30min，离心去上清，PBS漂洗。加入体积分数0.001Tritonx100室温孵育20min，离心去上清，加入PE结合的单克隆活化Caspase3抗体避光室温孵育30min，过筛后流式细胞仪检测。标记了PE的抗体只与活化的Caspase3结合，不与酶原形式的Caspase3结合，应用流式细胞仪即能分辨出表达活化的Caspase3细胞。实验重复3次。　　1.6ol/L）ISA处理组细胞于1.5mL的EP管中，PBS洗涤2次后，每管中加入150μL细胞裂解液在冰上裂解30mi

6、n，4℃下以12000r/min离心5min,收集上清液,考马斯亮蓝法测定蛋白质浓度。蛋白质样品与上样buffer按4∶1混匀，煮沸3min。每孔上样40μg，120g/L的SDSPAGE胶分离样品。于室温恒流40mA(1.5h)将蛋白转至PVDF膜上，用50g/L的脱脂奶粉（溶于TBS)室温封闭2h，将膜与溶于一抗稀释液(10g/L脱脂奶粉,溶于TBS中)中的一抗(兔抗人βactin抗体1∶300；兔抗人ICAD抗体)封于塑胶袋中，4℃过夜，室温孵育2h，TBST洗15min共3次，将膜与溶于二抗稀释液(10g/L脱脂奶粉，溶于TBS中)中的二抗室温孵育3h，

7、TBST洗15min共3次，将膜包在保鲜膜中，加入ECL发光试剂，暗室暴光，显影，定影，对X线底片进行扫描,对结果进行吸光度分析。实验重复3次。　　1.7统计学处理采用SPSS11.5统计学软件进行数据处理，数据间比较采用单因素重复测量方差分析。　　2结果　　2.1凋亡细胞形态学变化400μmol/LISA处理组在荧光显微镜下观察到典型的凋亡形态学改变：细胞质浓缩、核染色质聚集。而对照组细胞核呈均匀的蓝色荧光。　　2.2细胞凋亡率100、200、400μmol/L的ISA均可诱导SHSY5Y细胞发生凋亡，细胞凋亡率随药物浓度增加而增加，分别为（7.99±0.1