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1、2，3吲哚醌对人神经母细胞瘤SHSY5Y细胞增殖【摘要】目的研究2,3吲哚醌对人神经母细胞瘤SHSY5Y细胞增殖的影响。方法应用MTT比色法观察2,3吲哚醌对SHSY5Y细胞生长的抑制情况；流式细胞仪检测2,3吲哚醌对SHSY5Y细胞周期分布的影响；ethodsMTTmethodinetheeffectsof2,3dioxoindolineontheproliferationofSHSY5Ycells,andfloetrytodeterminethecellcycle.I1640培养基购自Gibco公司；新生牛血清购自
2、杭州四季青公司；四唑氮蓝（MTT）为Sigma公司生产；2,3吲哚醌购自上海元吉化工有限公司，实验时使用RPMI1640溶解并过滤除菌。caspase3一抗、SP试剂盒，购自北京中杉生物技术有限公司。牛血清清蛋白（BSA）购自Amresco公司。兔抗人有丝分裂原激活的蛋白激酶(ERK)抗体购自武汉博士德生物工程公司。过氧化物酶标记的驴抗兔抗体购自Amershampharmaciabiotech。1.2方法1.2.12,3吲哚醌对SHSY5Y细胞形态影响的观察将对数生长期的SHSY5Y细胞消化后，调整细胞浓度为109/L，接种
3、于培养瓶中。37℃、体积分数0.05CO2条件下孵育36h后换新培养液，并加入2,3吲哚醌，使其终浓度分别为0、100、200、400μmol/L，培养48h后，倒置显微镜下观察细胞形态的变化。1.2.22,3吲哚醌对SHSY5Y细胞的生长抑制作用检测采用MTT比色法［5］。取对数生长期的SHSY5Y细胞，调整细胞浓度为108/L，接种于96孔板中，每孔细胞数1×104个，接种36h后换新培养液，实验组加入2,3吲哚醌，使其终浓度分别为50、100、200、400μmol/L，同时设立空白对照组（不加2,3吲哚醌，加入等体
4、积的RPMI1640培养液）。每孔体积为200μL，每个浓度设12个复孔，分别培养24、48、72h后，每孔加入新鲜配制的MTT（10g/L）10μL，继续培养4h后，去除培养液，每孔加入100μLDMSO溶解结晶30min，用自动酶标仪（Rayto2100C酶标仪）于490nm处测定吸光度值。重复3次，取平均值，计算细胞生长抑制率。1.2.32,3吲哚醌对SHSY5Y细胞周期影响的检测取铺满瓶底的SHSY5Y细胞，去掉原液，加入新的细胞培养液准确调至5mL。24h后分别加入0、100、200、400μmol/L浓度2,3吲哚
5、醌，作用48h后收集细胞，调整细胞浓度为(0.5～1.0)×109/L。将细胞悬液离心，弃上清，分别加入碘化丙啶（PI）作用30min，然后，用流式细胞仪（BectonDickinson，美国）进行细胞周期分析，每个样本分别约检测11000个细胞，计算各期细胞数占细胞总数的百分率。1.2.42,3吲哚醌对SHSY5Y细胞caspase3蛋白表达影响的检测采用免疫细胞化学SP技术，取经100、200、400μmol/L2,3吲哚醌诱导的SHSY5Y细胞，以未经处理的细胞作为对照。分别用40g/L多聚甲醛固定，按SP试剂盒说明操
6、作，其中caspase3一抗效价为1∶50。光学显微镜下观察并判断结果，细胞染色呈棕褐色或棕黄色为阳性。caspase3蛋白定位于胞浆，也可见于胞核。连续观察5个高倍视野，计算阳性细胞百分率。1.2.52,3吲哚醌对SHSY5Y细胞信号传导蛋白ERK的影响取4瓶经0、100、200、400μmol/L2,3吲哚醌诱导的SHSY5Y细胞，细胞总蛋白的提取及期低于其他3组，差异均有显著性（F=17.29～48.01，q=7.12～19.87，P<0.05）；200μmol/L组的3项指标与其他3组比较，差异均有显著性（q
7、＝3.04～15.96，P<0.05）。见表1。2.42,3吲哚醌对SHSY5Y细胞caspase3蛋白表达的影响对照组、2,3吲哚醌100、200、400μmol/L组caspase3蛋白阳性细胞数分别为（15.8±5.4）%、（25.6±8.2）%、（26.8±10.1）%、（28.9±12.1）%，加药组SHSY5Y细胞中caspase3蛋白阳性细胞数较对照组明显增多，差异有显著意义（F=25.65，q＝10.29，P<0.05）。随着2,3吲哚醌剂量的增加，其表达量有明显增多的趋势。2.52,3吲
8、哚醌作用后磷酸化的有丝分裂原激活的蛋白激酶蛋白（ERK1/2）相对表达情况400μmol/L不同浓度2,3吲哚醌组ERK1/2相对表达量分别为（81.43±5.42）%、（79.94±6.23）%、（79.01±9.1
