caspase+8在trail死亡受体途径中诱导神经母细胞瘤细胞凋亡的作用

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1、中国医科大学研究生学位论文独创性声明本人申明所里交的学位论文是我本人在导师指导下进行的研究工作及取得的研究成果。，据我所知，除了文中特别加以标注和致谢的地方外，论文中不包含其他人已经发表或撰写过的研究成果，也不包含为获得我校或其他教育机构的学位或证书而使用过的材料，与我一同工作的同志对本研究所做的任何贡献均已在论文中作了明确的说明并表示谢意．申请学位论文与资料若有不实之处，本人承担一切相关责任．论文作者签名：醛整堡日期：竺至二-可中国医科大学研究生学位论文版权使用授权书本人完全了解中国医科大学有关保护知识产权的规定，即：研究生在攻读学位期间论文工作的知识产权

2、单位属中国医科大学．本人保证毕业高校后，发表论文或使用论文工作成果时署名单位为中国医科大学，且导师为通讯作者，通讯作者单位亦署名为中国医科大学．学校有权保留并向国家有关部门或机构送交论文的复印件和磁盘，允许论文被查阅和借阅．学校可以公布学位论文的全部或部分内容(保密内容除外)，以采用影印、缩印或其他手段保存论文。论文作者签名：丛垄堡指导教师签名：签邀雏(一面鬲丽i]Caspase8在TRAIL一死亡受体途径中诱导神经母细胞瘤细胞凋亡的作用前言与目的神经母细胞瘤(neuroblastoma，NB)是儿童常见的颅外实体瘤，年龄超过1岁、伴随1号染色体短臂杂合性缺

3、失、有N—MYC扩增的NB患儿预后不良，且对目前疗法包括外科手术、化疗、干细胞移植等的疗效不是十分理想，其中对传统化疗耐药和肿瘤转移扩散是临床面临的主要难题。因此临床上不断探索新的抗肿瘤方法，通过激活肿瘤坏死因子相关凋亡诱导配体(tumornecrosisfactorrelatedapoptosisinducingligand，TRAIL)途径诱导肿瘤细胞凋亡可能成为NB治疗的一个热点。TRAIL的选择性诱导肿瘤细胞凋亡的特性使其具有良好的临床应用前景，而且已有众多研究报道TRAIL与1一干扰素

4、高各种耐药的肿瘤细胞对TRAIL的敏感性。TRAIL是肿瘤坏死因子(TNF)超家族中的一员，与TNF、FASL(FAS配体)不同的是TRAIL能诱导多种肿瘤细胞与转化细胞发生凋亡而对正常细胞无诱导凋亡作用。正常情况下，TRAIL粘附于5个受体，死亡受体(deathreceptor，DR)DR4、DR5，诱捕受体(decoyreceptor，DcR)DcRl、DcR2及护骨素(osteoprotegerin，OPG)，诱捕受体与死亡受体相似，但缺乏功能性细胞内死亡区域，不引起凋亡级联反应。TRAIL通过黏附于死亡受体启动半胱一天冬氨酸蛋白酶(cysteinec

5、ontainingasparatespecificprotease，Caspase)级联反应导致程序化细胞死亡。在这一过程中死亡受体的活化导致Caspase8的激活，通过细胞内一种叫做FAS相关蛋白的细胞内媒介蛋白，活化的Caspase8直接激活效应Caspase—Caspase3，引起NB细胞凋亡。大多数NB细胞株因其Caspase8表达的缺失而对TRAIL诱导的凋亡不敏感。NB细胞中Caspase8基因沉寂的原因是其启动子区域高度甲基化，如何恢复NB细胞中Caspase8的表达及其对TRAIL的敏感性成为当前NB研究的一个热点问题。本研究中我们用去甲基药

6、5氮杂胞苷(5一Aza．cytidine，5AZA)、IFN叭TRAIL及化疗药联合作用于NB细胞株CHP212、SH—SY5Y(SY5Y)、SKNDZ，探讨NB细胞对TRAIL抵抗的分子机制，以及联合用药是否可以克服肿瘤耐药性，为TRAIL的临床应用提供理论依据。方法1．RT—PCR检测5AZA、IFNl作用前后Caspase8mRNA的表达及IFN7作用前后TRAIL、TRAIL受体DR5和其它凋亡相关基因的表达。2．细胞免疫组化方法及免疫印记实验(Western—blot)检测5AZA、IFNl作用前后Caspase8蛋白的表达；并用Western—b

7、lot技术检测CHP212、SYSY、SKNDZ细胞DR5蛋白的表达及化疗药处理后SKNDZ细胞DR5蛋白的表达。3．MTr细胞毒实验分组如下：(1)以5斗mol／L5AZA培养5d的SY5Y细胞为实验组，未用药物处理的细胞为对照组，分别给予0、50、100和200／xg／LTRAIL处理12、24和48h。同时设抑制剂组(5卜mol／L5AZA处理5d后，先加Caspase8抑制剂zlETD—FMK预处理1h后再用不同浓度TRAIL处理24h)。(2)CHP212细胞实验分3组：不同浓度TRAIL处理24h组；100肛g／LTRAIL作用不同时间组；Cas

8、pase8抑制剂组。SY5Y细胞实验分4组：单用不同