未成熟dc体外扩增诱导大鼠小肠移植免疫耐受的实验研究

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1、未成熟DC体外扩增诱导大鼠小肠移植免疫耐受的实验研究作者：李朝阳　阮长乐　张曙光　李光新　王坤【摘要】目的：通过体外扩增培养大鼠未成熟DC，采用术前预先输入受体体内的方法，了解未成熟DC诱导小肠移植免疫耐受的可行性。方法：体外应用不同细胞因子（GM-CSF或GM-CSF+TGFβ1）培养骨髓和肝脏来源的未成熟DC，阴茎背静脉输入ethods:DendriticcellsisolatedfromliverorbonemarroatureDCsfromvenadorsalispenisandobserved.Themodelsofheterotopicsmallbomuno-

2、rejectionlevelsmatureDCcaninduceallogenicimmunologicaltoleranceofratsmallboallbomunetolerance·Rat　　小肠移植被认为是腹腔移植中较难以攻破的堡垒，阻碍小肠移植发展的主要因素是免疫排斥反应。与单独小肠移植相比，肝、小肠联合移植发生急性或慢性排斥反应的概率均有所下降［1-2］。　　肝脏对小肠的免疫保护作用与肝脏中的未成熟树突细胞（dendriticcell，DC）有重要关系。本研究通过观察移植小肠免疫排斥反应的变化，了解未成熟DC诱导小肠移植免疫耐受的可能性及供体、受体未成熟DC诱

3、导免疫耐受的不同；观察分别来源于骨髓和肝脏的未成熟DC对诱导大鼠小肠移植免疫耐受作用的异同。1　材料与方法1.1　实验动物及分组　成年近交系雄性SD大鼠60只作为供体，随机分为6组；封闭群-CSF培养）预处理受体；C组：SD→-CSF培养）预处理受体；D组：SD→-CSF+TGFβ1共培养）预处理受体；E组：SD→-CSF+TGFβ1共培养）预处理受体；F组：SD→-CSF培养）预处理受体。1.2　主要试剂　TGFβ1（Sigma公司产品）；重组大鼠粒细胞/巨噬细胞集落刺激因子（granulocytemacrophagecolonystimulatingfactor,GM

4、-CSF，Sigma公司产品）；10%RPMI1640培养液（Hyclone，用干粉按常规配制成，美国）；胰酶（Hyclone，美国）；MHCⅡ类抗原、CD80、CD86单抗（晶美公司提供）；Ⅳ型胶原酶（Sigma公司产品）。1.3　骨髓来源未成熟DC的分离和培养1.3.1　制备大鼠骨髓细胞　取健康成熟雄性SD或I1640培养液中，2×106/孔置于8孔培养板中，每孔加细胞因子GM-CSF20μg/L,37℃、5%CO2培养，每2天更换并丢弃部分粒细胞和巨噬细胞，加细胞因子1次。培养第5～9天收集未成熟DC。1.4　肝脏来源未成熟DC的分离和培养1.4.1　分离肝树突状细

5、胞前体　选用成年雄性-CSF20ng/mL,37℃、5%CO2培养，每2天更换并丢弃部分粒细胞和巨噬细胞,加细胞因子1次。培养第5～9天收集未成熟DC。1.5　大鼠未成熟DC+TGFβ1共培养　方法同培养骨髓源未成熟DC，仅将加入的细胞因子由GM-CSF20μg/L改成GM-CSF20μg/L+TGFβ110μg/L。同样于培养第5～9天收集未成熟DC。1.6　DC成熟状态鉴定　每天倒置显微镜下观察细胞生长状况并摄影，第3、5、7、9天用扫描电镜观察以判定DC成熟状态，制作扫描电镜标本，于培养第5～9天收集DC，并于第5、8、9天FACS流式细胞仪检测CD80、CD86，

6、MHCⅡ类抗原弱表达进一步判定DC未成熟状态。1.7　DC免疫生物活性的检测　四甲基偶氮唑盐法（methylthiazolyltetrazoliumassay，MTT）检测各组DC刺激同种异体大鼠淋巴细胞的增殖能力。1.8　样本处理及结果判定　将所收集的未成熟DC经阴茎背静脉输入受体Wista大鼠体内，2×108/只。观察大鼠一般状况。1周后行SD→Wistar大鼠异基因移植组盲袢式小肠移植。术后第1、3、5、7天分别自各造瘘肠段切取造瘘肠管做常规病理组织切片评定移植小肠的免疫排斥反应分级。结果判定标准：轻度，肠黏膜绒毛轻度畸形，间质有少量炎性细胞浸润，上皮细胞凋亡数目增

7、加；中度，肠绒毛畸形更明显,黏膜上皮开始有脱落,细胞浸润加重,上皮细胞凋亡数目显著增加；重度，肠绒毛结构消失,上皮脱落，肠壁变薄并坏死，间质大量炎性细胞浸润，血管炎显著。1.9　统计学处理　应用SPSS10.0统计学软件进行分析，移植肠免疫排斥反应强度比较用Radit法分析；生存率用乘积极限法计算。P≤0.05为差异有统计学意义。２　结果2.1　培养DC光学显微镜观察结果　大鼠DC培养2d后出现悬浮生长，第3～5天可见部分前体细胞贴壁生长，细胞形态以小而圆为主，无树枝样突起，大约7d可见部分细胞悬浮,但毛刺较短,分支较少。9d