腺病毒介导的CTLA4Ig基因诱导大鼠同种肝移植免疫耐受的实验研究

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1、浙江大学硕士学位论文腺病毒介导的CTLA4-Ig基因诱导大鼠同种肝移植免疫耐受的实验研究姓名：蒋国平申请学位级别：硕士专业：外科学（普通外科）指导教师：郑树森2003.5.10鞭鋈盔兰篓主璺壁墼—一腺病毒介导的甜潍4一Ig蒸西诱爵穴鬣同种肝穆槛免疫耐爱的安黢研究硕士研究生罨帮蒋网平赛鞲森魏士孛文祷要舅豹本实验和餍瓣闭群鼢大蘸鄹避变系Wistar大藏的简种异体原位翳脏移植模憋，以V烈复裂缺雅型辣病毒为载俸，姆CTLA4-Ig基艘譬入珙瓣内，以缡鹨§一攀耗藉萤酶豹骧瘸褥(Adex／LacZ)为对照．搽讨CTLA4-19基因对同种辩体肝脏移植后的免疫耐受的诱导体鹈及瓿瑾；并蘧迓体癸实验鞣

2、突重终CTL&4一Ig爨会虽囱黠匿囊纲蕤功蕤鲢影璃。／，方法l-建立供体封闭群SD大鼠到受铺蜒苎系wistar大鼠鼬间种异体骧位肝脏移植模趔·袅分短：

3、疆(簿整蠢移耩织)为Wistar丈躐掰幂istar大鼠眸移萑；ll雏(捧痒对照疆)为sD犬鼠到Wistar丈鬣翳移植：m组(CsA处理缎)为SD犬鼠到Wistar大轼翳移植后用环孢霉素A(CsA)3．Omg／kg／d肌肉液射，共注射13天；Ⅳ维(CTLM-Ig旗因组)袭船大鼠捌#istar丈鬣瓣移植翦?天供体∞丈戴溪茎曹黪皴洼封禽露CTLA4一Ig基强的重缀腺病毒液1×ld中附，菸一次：V组(LacZ+藜囡组)为SD大鼠到Wista

4、r大鼠肝蓼獯藏?天供薄sB夫魏溺茎鬻静辣注射禽鸯kez'萋嚣静藤瘸毒菠t×l德≮督，共一次。3，观察揩标：各组大鼠的术艏情况、生存时阍。在移槌后第1、3、5、7、12天时间段各杀死3最，酶链热痰壤酪试验(B”BISA)橙溅键繇盘串l卜2，IL-4、IL-IO帮IFN-￥承平；逆转最多聚酶键反应(RT～PCR)检测移植物中细胞因子表达；免疫组织化学(IHC)检测移檀耪中CTLA4一Ig基爵盼表达及歪噬细穗帮蕊’绷耱等免癀缎施浸润状况；TdT介导的d{JTP缺口柬端标记技术㈣NEL)观察移撼物细胞獭亡槽况；器时备对蕊段蓼缝甥豹组织切片行排斥反应的病瓒学分缀。塑望查堂跫主堂业墨一《．薅势

5、实验及鼹寨指标；分离壤莽整寨悫瑟者舞爨矗弱蘸噬缀熬，题会或不鑫Lps(10ng肺1)的有血清培养基培器6小时麟．用CsA0．5¨g／ml、不同浓度的CTLA4一Ig嫩蕴燮商爱嚣者联合使耀，势囊鲑壤量辔绻鼹，莠设樱盛装度天Ig为对照，2《夺爵器掰ELISA法检测细胞上清液中TGF—B1、VEGF等细胞因子的袭迭。结果i+穆撼火魏寥澹对瀚；捧岸辫慧缎秽挺夫鼠撑活酵婀警均为13。l?天，每LacZ’毯理缓期避(平均为12．33天)；岛这两组相比，CTLM-Ig熬阁组和CsA处理组移植大鼠存活时问襞最疆长?}。差舅有爨蔫牲意义(P。2．CTLA4-Ig基翻：静脉注射cTLA4-I

6、R基因熏组腺病毒詹7天的sn大鼠肝脏中已肖cTLA4一lg基霹表达，纛来经筵懋翡供僖鞠夫鬣瓣照嚣鬻萎鹜黪赫滚辫含有弧eZ基露熊熏缎稼斌毒麝7天的SD太鼠肝脏均无C孔A4一Ig熬因阳性亵达。CT¨4一Ig组搓移植术后60天，移檬瀚中仍髓捻溺蜀甜LA4-Ig慕茵酶表达。3，细飑因子变化：在排斥对照组鄹LacZ+基嗣组疆环嫩中I卜2、I辨y靛表达水平耪对较高，黼cTLA4-Ig基因缀和CsA处理组IL-IO的表达水平较前两组商，CsA处壤组循环舷孛绌髓嚣子承平瓣变纯奔予撵露对照缓岛CT强4-18墓嚣錾之惩。4，免癀细胞浸润状况：排斥对照组和LacZ‘然因组移摭肝在术艏第3天艨cDt+T细

7、胞浸润增荔；娌强4一tg罄蓠踅魏匿整缨麟浸襄穗掇鳃显较蒸恁癯多；e蛙箍骥鳝戆蚕隧龌施浸澜介于上述三组岂间。CD8+T细胞漫润方面，排斥对照组较cTLA4-Ig熬因组和CsA处理组甓量，e耗嬲一{g基霞缀e98T缨藏浸满鞍CsA处理瘸轻。5．细胞凋亡：排_f搴对照组翱Lacz+罄因组凋它指数(AI)明显璃子cTLA4-Ig基髅组和e8A处理鳃，差异宵显著性意义。cTL^4一Ig缀奄CsA姓域组相瞎较，各时间段差异鬻显著幢。在备缀排蓐反废孛均可怒掇亡缨熬存在，发生稠亡嬲缨胞主爱是翳瓠艟，置疆亡糖鼗(矗{)与急性排斥反应的分缎成正相关。8．移蘸糕糍I塑捧斥转缓：在穆莲拳慧繁3天及罐露吝鼯

8、潜受蕊躲《一；g缀帮溉处遴鎏夫簸的排斥程度明娃比排斥对照组和LacZ维轻{第12最时间段钟LA4一Ig处理组太鼠的排斥·2-浙江大学硕十学位论文程度较CsA处理组轻。7．体外实验：经LPS刺激后的臣噬细胞在CTLA4一Is融合蛋白处理组上清液中TGF—B1含量较低，并随着CTLA4-Ig用药剂量的增加，TGF—B1含量呈现下降趋势．而CsA处理组TGF—B1含量明显增高，两者同时存在时，上清液中TGF—B1含量与CTLA4一Ig蛋白单独用药时的水平相近。在VEGF方面