f蛋白诱导大鼠肝移植免疫耐受的初步分析

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1、天津医科人学硕+学位论文中文摘要随着肝移植技术的不断进步和完善，使得越来越多的终术期肝病患者的生存期得到了很大程度的延长。但急性排斥反应(AcuteRejection，AR)仍然是肝移植术后最严重的并发症之一，其发生率仍然高达40％．60％，因此免疫耐受仍然是肝移植研究的重点之一。免疫耐受的机制有很多学说，各种高效免疫抑制剂也在不断推出，但是近年来越来越多的关注肝脏特异性蛋白(F蛋白)诱导肝移植术后免疫耐受的研究，使我们对肝移植免疫耐受的发生、发展有了更进一步的理解。F蛋白的表达及纯化本文在前人研究的基础上，将F蛋白原核表达载体pET-15b转化的大肠杆菌表达菌BL21(DE3)p

2、LysS，用IPTG诱导其表达，表达后通过亲和层析柱(Ni2+一—ch榷edIDAHi卜-blndcolumn)纯化，用十二烷基硫酸钠一聚丙稀酞胺凝胶电泳与免疫印迹(Westernblot)对其进行检测。人F蛋白的表达菌株BL21(DE3)pLysS表达后的全菌蛋白进行SDs_冲AGE电泳检测，目的条带分子量大小约为43kD，与文献报导一致。westernJblot显示纯化后的F蛋白与豚鼠抗人提纯F蛋白多克隆抗血清反应为阳性，说明我们经基因工程方法得到的纯化的F‘蛋白具有免疫活性。F蛋白诱导大鼠肝移植免疫耐受的初步研究为了观察两种不同品系即近交系Wistar和封闭群SD大鼠原位肝移

3、植术后的急性排斥反应及F蛋白诱导肝移植免疫耐受的情况。我们将健康雄性清洁的近交系Wistar和封闭群SD大鼠随机分为3组，A：同基因对照组：SD--}SD；B：急性排斥组：Wistar---，SD；C：F蛋白干预组：术前一周胸腺内注射0．4mg。采用Kamada一--袖套法，建立上述Wistar和SD组合之间的肝移植模型。A、B和C组受体分别于术后3d、6d、9d及lOOd，四个时间点各杀死三只大鼠，收集肝组织和血清分别做相应检测，另留取部分新鲜肝组织立即置入液氮中保存备用。剩余的大鼠用于观察肝移植术后长期生存率。实验过程中共完成108例次大鼠原位肝移植(ratorthotopic

4、livertransplantation，ROLT)操作，总的手术成功率为62．96％(68／108)，其中模型训练的前期完成45例，24h成活率仅24．44％(11／45)以后随着手术技巧成熟，手术成功率逐渐达到90％以上。大鼠肝移植手术死亡的主要原因为出血、麻醉意外、无肝期太长、血栓形成等。A组同基因对照组，术后组织学检查无排天津医科人学硕十学位论文斤反应表现。B组急性排斥组自术后3d开始，出现I级排斥反应，6d以后逐渐达到高峰，大多数死于术后12～21d。C组F蛋白干预组办未见确切排斥反应证据。结果表明：(1)二袖套法操作简便，手术成功率高，可作为肝移植实验的有效手段。(2)

5、成功建立大鼠原位肝移植模型的关键在于完善的手术技术，主要包括高质量的供肝获取、熟练的显微血管吻合技术和尽量短的无肝期。(3)近交系Wistar和封闭群SD大鼠之间建立的原位肝移植模型，能满足急性排斥反应或免疫耐受实验研究的需要。(4)F蛋白可以诱导大鼠肝移植免疫耐受。关键词：F蛋白基因工程大鼠原位肝移植二袖套法免疫耐受IIAbstractWiththecontlnuousprogressoflivertransplantationandimpr0Ve，m撕ngmore觚dmorethesurvivalofpatientswithend-stageliverdiseasehaSbee

6、llaIargedegreeofextenslomHowever,acuterejection(AcuteRejection，AR)atierliver咖Spl锄t撕on胁ainsthemostseriouscomplication，itsincidencer觚ainshi曲at40％-60％,soimmunetoleranceisstillthefocusofthestudyof1iVef‰splalltation．1nerearem柏ymechanismsofimmunetolerancetheory,av撕etyofe髓ctive1nlmunosuppresSiveagent

7、sareconstantlyintroduced，butmoreandmoreattentioninrecelltyears，meliverspecificprotein(Fprotein)induction0fimmunet01％mcea胁llVer仃￡mSplalltationresearch，SOthatweontheocculTenceoflivcr仃aIlsplanttolerance,thedevelopmenthasbeenfurtherundersto