ido基因修饰未成熟dc诱导哮喘免疫耐受的实验研究

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1、第三军医大学博士学位论文IDO基因修饰未成熟DC诱导哮喘免疫耐受的实验研究术摘要支气管哮喘(哮喘)是一种由多种炎症细胞参与的慢性气道变应性炎症性疾病，其发病机制尚未完全阐明【l'2】。“Thl／Th2偏移”假说被认为是哮喘发病的主要免疫学机制，该假说认为Th2细胞的过度活化导致了Th2反应为主的免疫反应，Th2型细胞因子IL一4、IL一5、IL一13等分泌增多在哮喘的气道炎症发生发展中起关键作用[3-51。正常人接触过敏原后不会发生Th2细胞的过度活化，这是因为正常人可以对过敏原产生免疫耐受。而哮喘患者由于免疫耐受缺

2、陷导致接触过敏原后T细胞异常活化，增殖和分化为Th2细胞，引起“Thl／Th2偏移”，始动哮喘的气道炎症。吲哚胺2，3一双加氧酶(indoleamine2，3一dioxygenase，IDO)是色氨酸分解代谢的限速酶，可形成局部低色氨酸环境【6】，抑制活化的CD4+T细胞增殖，诱导免疫耐受。树突状细胞(dendriticcell，DC)是目前已知功能最强大的抗原呈递细胞(antigenpresentingcell，APC)，它既是气道变应性炎症的始动因素，也可能是介导免疫耐受的枢纽环节，在激发免疫反应和诱导免疫耐受两

3、方面均起关键作用【7‘10】。本研究应用pEGFP—N1-IDO基因真核表达载体转染未成熟DC，并观察IDO基因对卵蛋白致敏／激发小鼠模型CD4+T细胞的影响；将pEGFP—N1-IDO基因真核表达载体转染未成熟DC移入卵蛋白致敏／激发小鼠气道，观察对其气道炎症的影响，为临床防治哮喘提供新的思路。研究内容和方法：1．小鼠IDO基因的克隆及载体构建：RT—PCR法扩增IDOcDNA全长基因序列，并将其克隆至真核表达载体pEGFP—N1上。2．未成熟DC的分离、培养和鉴定：体外扩增小鼠骨髓来源的未成熟DC，采用光镜、扫描

4、电镜、透射电镜、流式细胞技术鉴定CDllc、MHCII、CD80和CD86分子。3．小鼠IDO基因转染未成熟DC中目的基因表达的鉴定：应用DOTAP脂质体转染剂将pEGFP—N1-IDO真核表达载体转染未成熟DC，转染后在倒置荧光显微镜下观察绿色荧光，用RT—PCR、Western—blot法鉴定基因转染未成熟DC中目的基因的mRNA4国家自然科学基金资助项目(30500231)第三军医大学博士学位论文和蛋白表达情况。4．pEGFP—N1-IDO真核表达载体转染对未成熟DC表面分子CDllc、MHCII、CD80和C

5、D86的影响。5．建立卵蛋白(OVA)致敏／激发小鼠模型：腹腔注射OVA和雾化吸入OVA途径来致敏／激发和激发小鼠，观察BALF中细胞总数和EOS计数、BALF中IL一4、IL一5和IFN一1，水平，病理切片观察小鼠肺部气道炎症变化。6。IDO基因转染未成熟DC对卵蛋白致敏／激发小鼠脾脏CD4+T细胞增殖、凋亡和分泌细胞因子的影响：分离卵蛋白致敏／激发小鼠脾脏CD4+T细胞和正常小鼠脾脏CD4+T细胞，分别与pEGFP—N1-IDO真核表达载体转染对未成熟DC共培养后，混合淋巴细胞反应和TUNEL法检测CD4+T细胞

6、增殖、凋亡情况，ELISA法检测细胞培养上清液中IL一4、IL一5和IFN—Y水平的变化。7．IDO基因转染未成熟DC对卵蛋白致敏／激发小鼠气道炎症的影响：将IDO基因转染的未成熟DC经气管注入卵蛋白致敏／激发小鼠体内，病理切片观察小鼠肺部气道炎症变化，进行BALF细胞总数和EOS计数，ELISA检测BALF中IL一4、IL．5和IFN吖水平。结果：1．用RT—PCR法成功扩增出mlDOcDNA全长序列，并将其克隆至真核表达载体pEGFP—N1得pEGFP—N1-IDO，测序后序列完全正确。2．获得小鼠骨髓来源的未成

7、熟DC。3．应用DOTAP脂质体转染剂将pEGFP—N1-IDO真核表达载体转染未成熟DC后，pEGFP—N1-IDO转染组和pEGFP．N1转染组在倒置荧光显微镜下可观察到绿色荧光，而对照组没有绿色荧光，RT．PCR可检测到相应目的基因mRNA的表达，Westernblot法可检测到相应目的蛋白的表达，而pEGFP—N1转染组和对照组不能检测到IDO的mRNA和蛋自的表达。4．pEGFP—N1-IDO真核表达载体转染对未成熟DC表面分子CDllc、MHCII、CD80和CD86的表达无影响，仍以未成熟型为主。5．成

8、功建立卵蛋白致敏／激发小鼠模型，BALF中细胞总数和EOS计数增高、BALF中IL一4、IL一5的水平增高和1FN—Y水平降低，病理切片观察卵蛋白致敏／激发小鼠模型病理切片肺部气道炎症变化。6一IDO基因转染未成熟树突细胞能抑制卵蛋白致敏／激发小鼠模型CD4+T细胞增殖，pEGFP—N1一IDO质粒转染组CD4+T细胞减少，与和pEGFP—N1