人骨肉瘤mg63多药耐药细胞亚系建立及生物学特性分析

《人骨肉瘤mg63多药耐药细胞亚系建立及生物学特性分析》由会员上传分享，免费在线阅读，更多相关内容在应用文档-天天文库。

1、人骨肉瘤MG63多药耐药细胞亚系建立及生物学特性分析作者：刘岩张德宝杨华　孙大辉【摘要】目的建立阿霉素(DXR)诱导的人成骨肉瘤MG63多药耐药细胞株亚系MG63/DXR10、MG63/DXR40、MG63/DXR100并观察其生物学特性。方法以DXR为诱导剂，采用逐步增加剂量的方法诱导MG63细胞，建立多药耐药细胞株亚系MG63/DXR10、MG63/DXR40、MG63/DXR100;MTT法检测药物敏感性;光镜、透射电镜观察细胞形态及超微结构变化，绘制细胞生长曲线;流式细胞术检测细胞周期、凋亡指数。结果(1)经DXR6个月的诱导建立了MG6

2、3/DXR细胞株亚系。(2)MG63/DXR对DXR的耐药指数为76.87，对长春新碱、氨甲蝶呤、环磷酰胺亦产生不同程度的交叉耐药。(3)光镜观察可见：MG63细胞排列规则，形态呈梭形，大小一致;MG63/DXR细胞株亚系排列不规则，大小不均，形态呈三角形、多角形及多核现象。透射电镜显示：MG63细胞膜平滑，粗面内质网较丰富;MG63/DXR细胞株亚系细胞表面突起增加，粗面内质网丰富，胞质内可见髓样小体、溶酶体及大量糖原池。(4)MG63细胞与其多药耐药细胞株亚系MG63/DXR10、MG63/DXR40、MG63/DXR100细胞生长曲线相近。

3、(5)细胞周期分析显示MG63、MG63/DXR10、MG63/DXR40、MG63/DXR100细胞G0/G1期分别为86.34%、83.67%、78.11%、68.81%;G2/M期分别为5.92%、7.45%、7.78%、10.90%;S期分别为7.74%、8.87%、14.11%、20.30%;而MG63/DXR与MG63细胞的凋亡指数无显著差异。结论(1)小剂量DXR为诱导剂建立了人骨肉瘤多药耐药细胞株亚系(MG63/DXR10、MG63/DXR40、MG63/DXR100)，MG63/DXR、MG63/DXR细胞对于甲氨蝶呤、长春新碱

4、、环磷酰胺产生不同程度交叉耐药。(2)MG63/DXR细胞株亚系细胞形态、超微结构、细胞周期分布与母系细胞MG63有显著差异，凋亡指数无显著差异。(3)MG63/DXR耐药细胞的存在及其分裂、增殖可能是导致骨肉瘤化疗失败和肿瘤局部复发的原因之一。【关键词】骨肉瘤;阿霉素;多药耐药;细胞周期骨肉瘤是一种好发于长骨干骺端的恶性肿瘤。Rosen〔1〕提出新辅助化疗(neoadjuvantchemoherpy)的广泛应用，使骨肉瘤的5年生存率已达60%以上，但恶性肿瘤化疗后多药耐药(multidrugresistance,MDR)现象仍是影响肿瘤患者化疗

5、疗效和预后的主要因素之一。本研究以人成骨肉瘤细胞株MG63为诱导对象，分析其生物学特性。　　1材料与方法　　1.1材料人骨肉瘤细胞株MG63购自上海中国科学院细胞库。阿霉素(DXR，汕头明治医药有限公司)、DMEM(Gibco)、小牛血清(CalfSerum)(Gibco)、胰蛋白酶(Promega)、EDTA(Promega)、二甲基亚砜(DMSO)(Sigma)。CO2孵箱(SANYOMCO17AIC，日本)、超净工作台(YZ875)苏净集团安泰公司，倒置显微镜(OLYMPUS，日本)。　　1.2方法　　1.2.1主要溶液的配制DMEM溶

6、液：用950ml去离子水溶解DMEM粉末13.4g，加入NaHCO33.7g，HEPES2.38g，调pH至7.4，加入青霉素和链霉素，使最终使用浓度分别为100U/ml和100μg/ml，使用时加入胎牛血清至终浓度为10%。0.25%胰蛋白酶0.02%EDTA：称取0.2gEDTA，用去离子水溶解后，加入2.5g胰蛋白酶，定容至1000ml。　　1.2.2MG63培养与传代MG63骨肉瘤细胞在含有10%小牛血清的高糖DMEM培养液(含青霉素100U/ml，链霉素100μg/ml)中培养。隔日换液1次。约3d长满后传代。按1∶3～5传代，继续培

7、养。　　1.2.3MG63多药耐药细胞株亚系的建立DXR加药浓度的确定：取96孔板，每孔接种5×103个细胞，培养24h后分别加入终浓度为0.1、0.4、1.0、4.0、10.0、40.0、100.0ng/ml的DXR。继续培养48h，观察细胞存活情况，确定起始加药DXR终浓度为1.0ng/ml。传代后将细胞分成实验组和对照组，实验组加入DXR终浓度1.0ng/ml，24h后换液，约3d细胞长满传代。对照组不加DXR，继续培养，约3d传代。实验组细胞稳定生长后，逐渐加大DXR浓度，依次为4.0、10.0、40.0、100.0ng/ml，每个浓度梯

8、度持续1个月，细胞传代后稳定生长。整个诱导过程6个月，传代48次。将终浓度为10.0、40.0、100.0ng/ml的细胞分别命名为MG