抗肿瘤药氯法拉滨的致突变性及溶血性研究

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1、抗肿瘤药氯法拉滨的致突变性及溶血性研究作者：李新华，孙昕昕，崔斐，王晓艳，边媛【摘要】目的了解氯法拉滨(简称CLO)对骨髓红细胞和雄性小鼠生殖细胞有无致突变和致畸作用，以及对外周血红细胞有无溶解作用。方法采用微核试验检测CLO对骨髓RBC的致突变性，采用精子畸变试验检测CLO对小鼠生殖细胞的致畸作用，采用人红细胞检测CLO的溶血性。结果经微核试验，CLO测试组与阳性对照组两组间差异无显著性(P>0.01)，与阴性对照组间差异有显著性(P<0.05)。精子畸变试验中，CLO测试组与阳性对照组之间差异无显著性(P>0.05)，而与

2、阴性对照组之间差异有显著性(P<0.01)。CLO在体外各时段不致人红细胞溶解。结论经检测，CLO同其他抗癌核苷酸类似药一样，可以引起体内增殖活性强的细胞的突变，以及生殖细胞的畸变;对人红细胞的溶解性为阴性。【关键词】氯法拉滨;微核试验;精子畸变试验;溶血性;致畸;致突变多数抗白血病药物的药理作用是以抑制肿瘤细胞DNA合成以及抑制某些聚合酶的作用从而阻止肿瘤细胞增殖为特征。所以，世界卫生组织(PAS株式会社出品，型号CX200。　　1.3动物8～12周龄昆明种小白鼠100只，雄性75只，雌性25只，由山东大学医学院新药评价中心提供，实验动

3、物生产许可证号为：SCXK鲁20030004。　　2实验方法　　2.1微核试验[2～4]　　2.1.1CLO试验组选用昆明种成年小鼠30只，雌雄各半，运达本室后称重标记，体重23～27g。饲养1周，以观察其健康状况使其适应本室环境，适当控制饮食，1周内使体重变化在4g左右。将CLO配成1mg/ml的浓度。给药：小鼠按200mg/kg灌胃给药，连续1周。骨髓涂片：第八天颈椎脱臼致死小鼠，解剖剪取胸骨;载玻片上滴加小牛血清，用止血钳挤压胸骨骨髓液点加于血清中。混匀，推片，自然干燥后滴加甲醇覆盖涂膜固定。染色：Giemsa染色，将固定好的涂片滴加Gi

4、emsa应用液，根据室温染色维持10～15min后，加2倍pH6.8磷酸盐缓冲液，继续染3～5min，用PBS冲洗，晾干。观察计数：用双盲法阅片，高倍镜下观察计数嗜多染红细胞的微核发生率，每只动物计数1000个细胞。　　2.1.2阳性对照小鼠10只，雌雄各半，饲养方法、条件同上。取针剂环磷酰胺200mg，加生理盐水8ml，再作1：10稀释，使之成为2.5mg/ml的浓度。每只小鼠按40mg/(kg·d)做腹腔注射，连续2天，间隔24h，末次注射后6h处死，取骨髓细胞方法、染色方法、观察计数同CLO试验组，计数阳性对照组的微核率。　　2.1.3阴

5、性对照取小鼠10只，雌雄各半，称重后以0.4ml/(25g·d)的剂量以生理盐水灌胃连续7天，计数微核率方法同上。　　2.2精子畸变试验此项试验选用健康雄性小鼠，体重23～27g。　　2.2.1CLO试验组选用健康雄性昆明种小鼠30只，以CLO20mg/kg灌胃给药7天后，处死小鼠、摘除附睾，用生理盐水将血液漂洗干净，置小烧杯中，用剪刀将附睾纵向剪开，加生理盐水1～1.5ml，用滴管反复适度吹打，使精子均匀散在液体中，静置1min。取上层悬液1滴，加在干净的载玻片上，盖上盖片，立即用高倍镜观察，检查精子的头部、体部和尾部的形态变化。以形态良好，

6、游动活泼的精子为正常。以无头、小头、胖头、双头、双尾、无尾及无定形为精子畸形[3，5]，计数1000个精子的畸变率。　　2.2.2阳性对照试验取雄性小鼠10只，腹腔注射环磷酰胺40mg/kg[5]，相当于体积剂量为0.4ml/(25g·d)，连续5天，取精子方法、计数精子畸变率法同试验组。　　2.2.3阴性对照取雄性小鼠10只，以0.4ml/(25g·d)的剂量做腹腔注射生理盐水，连续7天，用药时间、取精子方法、计数畸变率同试验组。　　2.3溶血性试验CLO测试物溶液以1mg/ml为原液进行稀释。　　2.3.1试管设定分设阳性对照、阴性对照试管

7、各1支，测试管1～5号，共7支。　　2.3.2红细胞悬液的制备无菌抽取健康志愿者O型血5ml，置50ml无菌锥形瓶中用玻璃珠摇晃去除纤维蛋白，然后分取1/2移入2支10ml刻度离心管中，各加入生理盐水5ml，混匀，离心1500rpm10min，弃上清，洗2次。将所得红细胞用生理盐水稀释成2%，备用[6]。　　2.3.3加样取试管7支，编号。按表1所示，分别加入各溶液。表1溶血性试验加样表(ml)　　第6管不加CLO溶液，只加红细胞溶液及生理盐水作为阴性对照;第7管不加CLO溶液和生理盐水，只加红细胞溶液和蒸馏水作阳性对照。1～5管为测试管，加入

8、不同体积的CLO溶液和不同体积的生理盐水，使其成为递减的终浓度。将各管置于试管架上轻轻摇匀，置37℃中进行恒温水浴4h，分不同时段观察各管的溶血和凝集