壳聚糖纳米粒基因载体的制备和体外转染实验研究

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1、壳聚糖纳米粒基因载体的制备和体外转染实验研究作者：王红梅，肖玉洁，韩正祥，高向阳3，裴冬生，杜秀平【摘要】目的制备基因载体壳聚糖纳米粒，研究其结构特征及其体外对细胞的转染活性。方法以复凝聚法制备壳聚糖-pDNA纳米粒;电镜测定其形态、粒径;凝胶电泳阻滞实验观察壳聚糖和pDNA的结合力;紫外可见分光光度计测定其负载力、负载率;体外转染入人胚肾细胞293T，荧光显微镜观察转染效率，CCK8法评价细胞毒性。结果壳聚糖-pGFP纳米粒多呈球形，直径为(132±48)nm;凝胶电泳阻滞实验示pGFP被完全包裹在纳米粒内;其负载力(LC)为(48.2±2.0)%，负载率(LE)为100

2、%;体外转染实验证明壳聚糖-pGFP纳米粒能介导pGFP转染293T细胞并在细胞中表达绿色荧光蛋白;壳聚糖-pDNA抑制率(26.08±4.28)%。结论采用复凝聚法制备的壳聚糖-pDNA纳米粒可有效转染至细胞内，但有一定的细胞毒性。【关键词】壳聚糖;纳米粒;基因载体;转染　　Abstract:ObjectiveTopreparechitosannanoparticlesasgenevectorssoastoinvestigatethEirstructuralcharacteristicsandcell-genetransfectionefficiencyinvitro.M

3、ethodsThechitosan-pDNAnanoparticlesethodandthEIrmorphologyasetericroscope.ThebindingofpDNAinedeter.Thetransfectionexperimentsedanembryonickidney293Tcelllineinvitro.Thetransfectionefficiencyeasuredunderfluorescentmicroscope.Thecytotoxicityainlyspherical,eterof(132±48)nm.Theagarosegelelectro

4、phoresisanalysisconfirmedtheDNAicroscope.Theinhibitionpercentageofnanoparticlesa-Aldrich公司，脂质体Lipofectamine2000购自Invitrogen公司，293T人胚胎肾细胞购自中科院上海细胞库，表达绿色荧光蛋白的质粒PGPU6/GFP/Neo-shNC购自上海吉玛公司，CellCountingKit-8(CCK-8)购自日本同仁化学研究所。　　1.2方法　　1.2.1细胞培养293T人胚胎肾细胞培养于含10%新生牛血清、1×108U/L青霉素、100mg/L链霉素的RPMI1

5、640+HEPES培养液中，置于37℃、5%二氧化碳培养箱培养。每3～5天按1∶3～1∶5的比例进行传代。　　1.2.2壳聚糖-质粒(pDNA)微粒体的制备(复凝聚法)取壳聚糖500mg，溶解于1%乙酸溶液，浓度0.5%(pH4.5)，超声震荡至澄清，121℃，高压灭菌20min备用。pDNA溶解于灭菌20%Na2SO4溶液中，浓度为25mg/L。取0.5%的壳聚糖与等体积的pDNA溶液混合，在漩涡混合器上充分混匀后，12000r/min、4℃离心20min，沉淀物以PBS重悬，此为壳聚糖-pDNA微粒混悬液。　　1.2.3壳聚糖-pDNA纳米粒的形态和粒径测定取少量壳聚糖

6、-pDNA纳米粒混悬液，滴至铺有碳膜的铜网上，静置2min，用滤纸吸干混悬液，再滴加1%(arker　　2.3壳聚糖包封pDNA测定应用UV法测定上清液中未结合pDNA浓度，在260nm处为负值，pDNA浓度为负值，经计算壳聚糖LC为(48.2±2.0)%，LE为100%，表明壳聚糖完全包封pDNA。　　2.4体外转染实验转染24h观察，脂质体质粒转染组有散在的绿色荧光点，壳聚糖质粒组无荧光点。48h时观察，脂质体组荧光明显增多，亮度增加，壳聚糖质粒组散在绿色荧光，亮度弱，部分细胞脱壁死亡(图3～6)。72h观察荧光均减少，壳聚糖质粒组死亡细胞增多，脂质体质粒组细胞状态基本

7、正常。　　荧光显微镜观察48h时转染率最高。壳聚糖-pDNA纳米粒组转染率〔(4.25±2.26)%〕，脂质体转染率〔(33.65±7.16)%〕(P<0.05)。　　2.5CCK8实验壳聚糖-pDNA抑制率(26.08±4.28)%、脂质体-pDNA抑制率(8.66±4.25)%、壳聚糖组抑制率(16.9±3.59)%，壳聚糖-pDNA组抑制率与脂质体-pDNA组相比有明显差异(P<0.05)。壳聚糖也有抑制细胞生长作用。　　3讨论　　壳聚糖是一种弱碱性的天然高分子多聚糖，在酸性条件下溶解，荷正电,能