基于硅氧烷的基因载体的制备及体内基因转染的研究

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1、摘要摘要本文旨在以硅氧烷纳米材料作为基础，引入阳离子聚合物，制备有机．无机杂化纳米基因载体。本文工作主要分为以下三个方面：1．以羧甲基壳聚糖、有机硅烷(GPSM)作为反应物，以氨水作为反应介质，在水相中制得羧甲基壳聚糖．硅氧烷(CMG)纳米颗粒。采用电子透射显微镜及粒径仪对CMG纳米颗粒的形貌、尺寸和表面电位进行表征。通过红外光谱、热失重分析等方法，对CMG纳米颗粒的结构进行了分析，并探讨了该基因载体的合成机制。为了提高该载体的功能性及结合DNA的能力，通过共价键连的方法将具有逃逸溶酶体功能的KALA活性多肽修饰到CMG纳米颗粒表面(CMG．KALA)。通过激光共聚焦、荧光光谱以及红外

2、光谱证明KALA可以成功地连接到CMG纳米颗粒表面；通过静电引力吸附将DNA与CMG．KALA纳米颗粒进行复合，并通过琼脂糖凝胶电泳证明该纳米颗粒对DNA具有很好的保护作用。因此CMG．KALA纳米颗粒具有作为基因载体应用到体外转染实验的潜力。2．在本课题组前期工作的基础上，为了赋予明胶硅氧烷(Gs)纳米颗粒更多的功能性，分别制备了具有穿膜作用、逃逸溶酶体作用以及核定位作用的多肽修饰的GS纳米颗粒，并通过静电吸附的方法将DNA与GS．peptide纳米颗粒进行复合。通过荧光光谱确定了纳米颗粒上不同多肽的连接率；通过粒径仪分析GS．peptide纳米颗粒的粒径及表面电位，并通过DNAst

3、ar分析软件对不同多肽的二级结构进行了模拟，确定了其发生螺旋及两亲性的氨基酸序列；通过激光共聚焦显微镜和琼脂糖凝胶电泳确定GS—peptide纳米颗粒与DNA的结合能力，进而筛选出最适合提高GS纳米颗粒DNA结合能力的多肽序列。3．根据本课题组前期对GS．Tat纳米颗粒的研究，以GS．Tat纳米颗粒为基因载体，以D．半乳糖苷酶为表达基因，对此基因体系进行小鼠体内生物分布和体内基因表达的研究，从而进一步确定其作为基因治疗体系的可行性。关键词：羧甲基壳聚糖．硅氧烷；功能多肽；体内基因转染AbstractThispaperWaSaimedtoprepareorganic—inorganich

4、ybridnano．genevectorbaSedonsilicananomaterialsandcationpolymersforgenedelivery．Thefollowingthreeaspectswerediscussedinthispaper：1．CMGnanoparticlesweresynthesizedthrougharapidone—stepaqueoussyntheticapproachwithcarboxymeth)j’lchitosan，GPSMandammoniasystem．Themorphology,sizeandsurfacepotentialwere

5、characterizedbyTEMandNano．ZSZetasizer．ThestructurewasdeterminedbyFTIRandTGA．KALApeptideWaSmodifiedtothesurfaceofCMGnanoparticlestoenhanceitstransfectionefficiencyasanon—viralvectoLThroughtheanalysisofFTIR,CLSMandfluorescencespectrometry,KALAWaSdemonstratedtoconnectedCMGnanoparticlessuccessfully．

6、AgarosegelelectrophoresisshowedthattheCMG—KALAnanoparticlesCanprotectDNAfromdegration．Thus，CMG-KALAnanoparticleshavegreatpotentialasgenevectorsfortransfectioninvitro．2．GS—peptidenanoparticlesweresynthesized嬲previousreportedmethodinordertoimprovetheabilityofcellpenetrating，endosomeescapingandnucl

7、eartargeting。Theconnectionratiowasdetectedbyfluorescencespectra。SizeandsurfacepotentialWasdetectedbyNano·ZSZetasizer．ThroughCLSMandagarosegelelectrophoresisDNAbondingabilityofGS—peptideWascharacterized．Basedonthepredictionof