多重修饰的明胶—硅氧烷纳米粒作为基因载体脑胶质瘤细胞靶向研究

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5、已经厦门大学保密委员会审定过的学位论文，未经厦门大学保密委员会审定的学位论文均为公开学位论文。此声明栏不填写的，默认为公开学位论文，均适用上述授权。)声明人(签名)：硼年摘要脑胶质瘤起源于脑部神经胶质细胞，是最常见的颅内肿瘤，其化疗效果欠佳的主要原因就是中枢神经系统受到血脑屏障的保护。血脑屏障(bloodbrainbarrier，BBB)是由脑内毛细血管的内皮和内皮细胞之间的紧密连接、基膜以及神经胶质细胞突起构成，这种结构的存在，阻止了极性分子在细胞旁的自由扩散。而且在大脑内皮细胞表面没有窗孔、吞饮小泡极少，98％的药物、外源基因不能

6、透过血脑屏障达到良好的药物浓度。近些年基因治疗的广泛开展，为脑胶质瘤的治疗提供了新的契机，因此高效性基因载体的研究变成了重中之重。作为非病毒药物载体中重要的一员，纳米粒子发挥着无可替代的作用，而其中的明胶．硅氧烷杂化材料，由于具有低毒性、可降解性、表面易修饰性以及易重复合成等优点在提高药物靶向性方面具有非常广阔的应用前景。本实验旨在构建一种经阳离子多肽和适配体共修饰的不但能够很好的被细胞摄取并能靶向脑肿瘤细胞的纳米粒子基因载体系统，并考察其携带质粒DNA在细胞水平的转染效率。本文工作主要分为以下三个方面：1．通过两步溶胶一凝胶法制备出

7、明胶．硅氧烷纳米粒子(gelatin．siloxanenanoparticlesGSNPs)后，通过静电吸附作用使得目的基因荧光素酶质粒pGL3连接，然后通过靶向识别人脑胶质瘤U251细胞的适配体TTAl(5’一CCTGCACTTGGCTTGGA们盯CAGAAGGGAGACCC一3’)、提高纳米粒子穿透血脑屏障和细胞膜的阳离子多肽TAT(YGRKKRRQRRR)、延长药物体内循环时间的聚乙二醇(Poly(ethyleneglyc01)，PEG)对其进行表面修饰。并经透射电镜、荧光光谱仪、Zeta电位仪、粒径仪等对其进行理化性能分析。实

8、验结果证实了适配体TTAl和阳离子多肽TAT可以成功连接到纳米粒子表面，其纳米粒子表面形态，修饰前后无明显差异；但纳米粒子直径，随着多重修饰的增加，粒径有不同程度的增大。2．通过体外毒性试验对经过适配体TTAl、阳离子多肽TAT、聚乙二醇(PEG)修饰后的明胶．硅氧烷粒子与DNA的复合物进行细胞生物相容性评价，实验证实，经多重修饰的明胶．硅氧烷纳米粒子细胞毒性较未经修饰的该纳米粒细胞毒性增I加，当各种纳米粒子与DNA的复合物的浓度为10099／mL时，与细胞共培养24h后，各组细胞的生存率均达到了80％及以上。仍然具有较好的生物活性。

9、细胞内吞实验通过荧光显微镜和流式细胞仪进行。结果证实，经TTAl修饰的明胶．硅氧烷纳米粒子较未经修饰的该纳米粒脑胶质瘤细胞靶向性能优越；再经阳离子多肽TAT修饰后，各组纳米粒子的透过细胞膜的能力均较前明显增强，并且可以使携带的目的基因在细胞内高效的表达。3．通过辣根过氧化物酶(HI冲)渗透实验以及紧密连接蛋白ZO．1的免疫染色检测，证实了可以利用商品化的人脑血管内皮细胞HCMEC／D3成功构建出良好的体外血脑屏障模型(BloodBrainBarriermodel，BBBM)。通过荧光光谱仪、荧光显微镜、化学发光仪等多种检测方法证实，经

10、TTAl和TAT修饰后的明胶硅氧烷纳米粒子较修饰之前具有良好的透过血脑屏障的能力，提高了质粒DNA在U251脑胶质瘤细胞的表达效率。关键词：脑胶质瘤；明胶．硅氧烷纳米粒子；适配体；阳离子多肽AbstractGliobla