表面改性plga纳米粒子制备及其作为基因载体的研究

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1、东南大学学位论文独创性声明本人声明所呈交的学位论文是我个人在导师指导下进行的研究工作及取得的研究成果。尽我所知，除了文中特别加以标注和致谢的地方外，论文中不包含其他人已经发表或撰写过的研究成果，也不包含为获得东南大学或其它教育机构的学位或证书而使用过的材料。与我一同工作的同志对本研究所做的任何贡献均已在论文中作了明确的说明并表示了谢意。研究生签名：次垂：盏日期：垒呈!皇：!：!!东南大学学位论文使用授权声明东南大学、中国科学技术信息研究所、国家图书馆有权保留本人所送交学位论文的复印件和电子文档，可以采用影印、缩印或

2、其他复制手段保存论文。本人电子文档的内容和纸质论文的内容相一致。除在保密期内的保密论文外，允许论文被查阅和借阅，可以公布(包括刊登)论文的全部或部分内容。论文的公布(包括刊登)授权东南大学研究生院办理。摘要目前基因治疗面临最大挑战是如何将外源治疗基因高效靶向运输到目标组织，因此构建具有较高基因转运能力同时具有较低生物毒性和生物相容性的基因载体成为目前研究重点。本课题首先用PEI和十六烷基溴化物合成两亲性聚合物PEI．cetyl，采用复乳化溶剂挥发法构建了PLGA为核PEI为壳的PLGA／cetyl．PEI纳米粒子(

3、PCPNPs)，以此为基础构建基因载体。为了增强纳米粒子对肿瘤细胞靶向作用和降低细胞毒性，用透明质酸(hyaluronicacidHA)对纳米粒子表面作修饰，形成PLGA／cetyl—PEI／HA纳米复合物(PCPHNPs)。对制备纳米粒子的形貌、粒径、zeta电位等理化性质分析。并对PCPH／pDNA复合物做作相关表征，N／P为12时的PCPH／pDNA复合物的粒径为150nm，表面电位为21．3mv；琼脂糖凝胶电泳显示PCPHNPs能够很好的与pDNA形成稳定的复合物，并对pDNA有保护作用。在体外细胞转染试验

4、中，采用PCPHNPs作为pEGFP的载体转染Hela细胞，通过对比不同转染试剂所表达的绿色荧光蛋白，证实PCPHNPs相较PEI、PCP具有高转染效率，并且略优于目前最常用的阳离子脂质体lipofecatmine2000。采用MTT法对新型纳米基因载体在最高效转染效率下的细胞毒性作评估，结果显示Hela细胞在PCPH最优转染条件下的存活率高于90％，证实PCPHNPs具有极低的细胞毒性。通过PCPHNPs基因载体抗血清特性研究表明在有血清和无血清的状态下PCPHNPs对细胞转染效率基本不变，表明其具有抗血清破坏特

5、性，能够保护携带基因不被降解。因此其可以直接加到细胞培养基中，转染前后无需更换培养基，简化转染程序。我们同时还考察了PCPHNPs作为稳定性较差的小RNA的载体，选取了anti．miR221作为研究对象，探讨了纳米粒子介导anti．mir-221对HepG2生长的影响，实验结果显示纳米粒子可以将anti．miR．221转运入肝癌细胞中，并能特异性的沉默细胞内的miR．221，进而引起肿瘤细胞的凋亡。说明纳米粒子不但可以作为pDNA的载体，也可以作为这类稳定性较差的小RNA的载体。因此，我们构建的PCPHNPs是一种

6、高转染效率、低细胞毒性、稳定性好，且适用细胞类型较广泛的基因载体，广泛适合于多种基因转染应用，是新一代聚合物纳米粒子基因载体的代表。而其简单，快捷的试验步骤，同样具有很好的优越性。关键词纳米粒子；基因载体；PLGA；PEI；肿瘤；miRNA东南大学硕士论文AbstractAtpresentthebiggestchallengefacinggenetherapyishowtoefficientlytransporttherapeuticexogenousgenestotargettissue，SOconstructs

7、afe，efficient,lowtoxicityandgoodbiocompatibilitygenecarriersbecomearesearchfocus．InthisstudywefirstlysynthetizedamphipathicPEI—cetylbycetylbromidealkylationofPEI，thenpreparedPLGAnanoparticlesdecoratingthesurfacewithCetylatedPEI(Cet-PEI)bydoubleemulsionsolvent—

8、diffusion．Inordertoenhancetheabilityofthenanoparticlesintotumorcellsandreducethetoxicity,weusedhyaluronicacid(hyaluronicacidHA)tocoatingnanoparticles’surfaceformingPLGA／PEI-cetyl／H