改性磷酸钙纳米基因载体的研究.pdf

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1、分类{}鱼呈垒】：鱼垒垒学校代码lQ5垒2密级学号—200814—020043改性磷酸钙纳米基因载体的研究Studyonthemodifiedcalciumphosphatenanoparticleforgenedelivery指导教师姓名、职称鱼墨盎整撞湖南师范大学学位评定委员会办公室二零一一年五月PEG．PolyethyleneGlycolPAA：Poly(acrylicacid)PBS．phosphatebufferedsalineE．coli：EscherichiacoliLB：Luria．BertanimediumKD

2、：16loDaltonTCP：tricalciumphosphateHAP：HydroxyapatiteKan：KanamycinsiRNA：smallinterferingRNAmRNA：MessengerRNADNA．deoxyribonucleicacid英文缩写表CPPs：Cationiccell—penetratingpeptidesDMEM：dulbeccoSmodifiedeaglemediumpEGFP—C1：EnhancedgreenfluorescentproteinTris：tris(hydroxymeth

3、yl)aminomethaneCaP：Calciumphosphatenanoparticle二甲基亚砜聚乙二醇聚丙烯酸磷酸㈣大肠杆菌LB培养基千道尔顿磷酸三钙碱式磷酸钙鱼精蛋白卡那霉素牛血清白蛋白小型干扰RNA信使核糖核酸脱氧核糖核酸阳离子穿膜多肽杜氏改良培养基增强型绿色荧光蛋白三(羟甲基)氨基甲烷传统型磷酸钙纳米颗粒●。。。。。。。●_-。。。。。。。。。’。。。。。。’。。。。。。。。。。’———————————————————————’———————————————————OPS．CaP：OPS．modifiedCaP1

4、PS．CaP：1％PS．modifiedCaP2PS．CaP：2％PS．modifiedC心4PS．CaP：4％PS．modifiedCaP传统型磷酸钙纳米颗粒鱼精蛋白占1％的改性磷酸钙纳米颗粒鱼精蛋白占2％的改性磷酸钙纳米颗粒鱼精蛋白占4％的改性磷酸钙纳米颗粒Ⅱ摘要由于具有低毒性、生物可降解性、易于使用和吸附DNA能力强等特点，磷酸钙纳米颗粒是目前广泛应用的非病毒载体之一，在许多哺乳动物细胞中进行体外转染取得了很好的效果。然而，传统型磷酸钙纳米载体的转染效果受到pH值、DNA和CaCl2浓度、温度、细胞类型和沉淀时间等多种因素

5、的影响，并且，相比阳离子脂质体和其他多聚体来说，磷酸钙转染的可重复性差；磷酸钙颗粒粒径会随着沉淀时间的延长而变大，从而导致转染效率降低。在临床试验模型中，阳离子穿膜多肽能将生物小分子及一些物质运输至大部分组织和细胞中。鱼精蛋白是一种类似于穿膜多肽的富含精氨酸的小分子多肽。在研究中，发现鱼精蛋白覆盖在DNA／磷酸钙复合颗粒的表面能起到稳定颗粒粒径大小的作用，基于此，我们开发了一种鱼精蛋白修饰的新型磷酸钙纳米基因载体。为研究鱼精蛋白涂层对鱼精蛋白．磷酸钙复合颗粒的粒径及转染效率的影响，我们采用pEGFP．C1增强型绿色荧光蛋白作为转

6、染效率的指示标记，并以传统型磷酸钙纳米基因载体作为对照；采用原子力显微镜观测颗粒的粒径大小和形态；用细胞生长抑制试验来测试载体对细胞的毒性作用。研究发现，在293FT，HEK293和NIH3T3细胞中，鱼精蛋白．磷酸钙复合颗粒的转染效率明显高于传统型磷酸钙纳米颗粒。原子力显微镜检测显示鱼精蛋白．磷酸钙复合颗粒的粒径明显小于传统磷酸钙颗粒。转染效率的差异可能与颗粒的粒径大小有关。与传统磷酸钙载体相比，鱼精蛋白．磷酸钙复合颗粒的稳定性明III显增强，在4oC保存一周之后，转染HEK293细胞，转染效率损失较小，这说明鱼精蛋白可能起到

7、稳定磷酸钙纳米颗粒的作用。细胞生长抑制试验表明两者的细胞毒性都较低，差异不大。因此，与传统磷酸钙载体相比，鱼精蛋白．磷酸钙纳米载体是一种更好的非病毒载体。关键词：转染效率；颗粒粒径；鱼精蛋白；稳定性IVAbstractCalciumphosphate(CaP)isoneofthewidelyusednon—viralvectorsforinvitrotransfectionofavarietyofmammaliancellsduetoitslowtoxicity，biodegradability，easeofuse，andads

8、orptivecapacityforpDNA．However，thetransfectionefficiencyoftheclassicalCaPmethodstronglydependsonpreparationparameters，suchaspH，conc