电击法磁性纳米颗粒作为水稻转基因载体的研究.pdf

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1、第38卷分析化学(FENXIHUAXUE)研究报告第5期2010年5月ChineseJournalofAnalyticalChemistry617～621DOI：10．3724／SP．J．1096．2010．00617电击法磁性纳米颗粒作为水稻转基因载体的研究王风华刘俊童春义汪启明唐冬英易龙王玲玲刘选明(湖南大学生命科学与技术研究院，化学生物传感与计量学国家重点实验室物理与微电子科学学院，长沙410082)摘要建了以磁性纳米颗粒为载体，由电击法介导基因导人植物细胞的优化方法。制备了粒径小于10nm的磁性纳米颗粒，与绿色荧光蛋白(Greenfluorescentpr

2、otein，GFP)基冈融合制备基冈载体，同时，制备水稻悬浮细胞，加入电极杯中，调节电击条件为：电压分别是800，1000和1200V，电容25IxF，电阻200Q，直径10IllIll，电击数次。利用倒置荧光显微镜观察转化后的悬浮细胞，可以明显看到绿色荧光蛋白存水稻细胞内表达。说明纳米颗粒基冈载体在电击作用下能有效进入细胞，利用磁性纳米颗粒作为基因载体电击法转化植物细胞初步成功。关键词磁性纳米颗粒；基因载体；电击；基因转导；水稻细胞1引言纳米颗粒(Nanoparticle，NP)基因载体以低或无生物毒性、无免疫原性、抗酶解能力强、高转染效率及转染后可获得稳定表达

3、等优点，在基因转导方面具有潜在的、广阔的应用前景，而且在动物和人体细胞的转基因研究中得到应用卜，但作为植物转基因载体研究却是个全新的领域，因为植物细胞具有阻碍纳米颗粒进入细胞的天然屏障细胞壁。为有效通过细胞壁、细胞膜、细胞核膜而使纳米颗粒基因载体进入细胞，本研究组已作了初步的研究，在超声波和基因枪的介导下，外源基因由纳米颗粒基因载体导入了植物细胞并获得了表达，。在此基础上，本研究借助电击的作用，使基因在纳米颗粒的运载下进入植物悬浮细胞并进行了表达。电击法的主要原理是利用高压电脉冲作用，直接在带壁的植物细胞上“电击穿孔”，然后将外源基因直接导人植物细胞，该技术简便易

4、行，提高了植物细胞的存活率，但该法是将DNA与细胞直接共同培养并电击，直接裸露的DNA受到电击、酶切的物理和化学损伤作用大，影响转化的效率，需要一种对DNA的保护机制，并能将DNA载人细胞又与细胞具有相容性，而纳米颗粒正具有这些特性：磁性四氧化三铁纳米颗粒直径可达10nm以下，具有比表面积效应，在纳米颗粒的表面可吸附大量DNA_1卜”，而且FeO晶体对细胞无毒，具有良好的生物相容性，在磁性FeO晶体表面可以很容易地包埋生物高分子，如多聚糖、蛋白质、DNA等形成核壳式结构¨。，因此磁性纳米颗粒可成为较好的基因载体。本研究有效结合电击法和纳米颗粒的优点，解决纳米颗粒基

5、因载体通过植物细胞壁这一难题，提高了植物细胞的转基因效率。2实验部分2．1仪器与试剂HJ一3恒温磁力搅拌器(江苏金坛医疗仪器厂)；JSM一5600LV扫描电子显微镜(日本Jeol公司)；5810R高速离心机(德国Eppendorf公司)；LGJ一10型真空冷冻干燥机(北京四环科学仪器厂)；TE2000u荧光倒置显微镜(日本Nikon公司)；GenepulserXcell(美国Bio—Rad公司)；UVPCDS8000PC凝胶图像分析系统(美国UVP公司)；Fe(NO)·9HO(天津市科密欧化学试剂开发中心)；NaOH(汕头市西2009—11—28收稿；201O_o

6、2_o3接受本文系国家高校“985工程”科技创新平台(No．200501)资助项目。E—mail：SWxmI@hnu．cn—618第38卷陇化]一厂)；FeSO·7H0(河南焦作市化工厂)；DNaseI和SDS(北京鼎国生物技术有限责任公司)；pEGAD质粒由美国加州大学林辰涛教授提供；其它药品和试剂均为分析纯，实验用水为超纯水。2．2磁性纳米颗粒的制备分别称取Fe(NO)，·9HO40．4g，FeSO·7HO13．9g，溶于】00mL二次蒸馏水中，再按体积比1：1混合于网底烧瓶中搅拌。控制温度在80，同时快速滴加6mol／LNaOH溶液4～6mI至pH=11，滴

7、加完毕时再加入一滴SDS，继续搅拌30rain。滴加完毕时再加入一滴SDS，控制温度在80℃，搅拌30rain，控制pHlI。反应结束后，将溶液进行离心，再用二次蒸馏水和酒精反复洗涤，直至pH=7。最后将所得的固体真空干燥过夜。2．3磁性纳米颗粒与质粒DNA结合将不同比例磁性纳米颗粒与质粒DNA混合，常温振荡结合3Orain，电泳检测磁性纳米颗粒与DNA的结合情况，同时在最佳结合比例时，用DNaseI处理，考察磁性纳米颗粒保护DNA免受DNA酶酶解的情况。2．4水稻悬浮细胞的培养(1)用镊子夹取出生长旺盛的松软愈伤组织，放入100mI三角瓶中并轻轻夹碎。每个j角瓶

8、含灭过菌M