壳聚糖纳米粒基因载体的制备和体外转染实验研究

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1、壳聚糖纳米粒基因载体的制备和体外转染实验研究作者：王红梅，肖玉洁，韩正祥，高向阳3，裴冬生，杜秀平【摘要】目的制备基因载体壳聚糖纳米粒，研究其结构特征及其体外对细胞的转染活性。方法以复凝聚法制备壳聚糖-pDNA纳米粒;电镜测定其形态、粒径;凝胶电泳阻滞实验观察壳聚糖和pDNA的结合力;紫外可见分光光度计测定其负载力、负载率;体外转染入人胚肾细胞293T，荧光显微镜观察转染效率，CCK8法评价细胞毒性。结果壳聚糖-pGFP纳米粒多呈球形，直径为(132±48)nm;凝胶电泳阻滞实验示pGFP被完全包裹在纳米粒内;其负

2、载力(LC)为(48.2±2.0)%，负载率(LE)为100%;体外转染实验证明壳聚糖-pGFP纳米粒能介导pGFP转染293T细胞并在细胞中表达绿色荧光蛋白;壳聚糖-pDNA抑制率(26.08±4.28)%。结论采用复凝聚法制备的壳聚糖-pDNA纳米粒可有效转染至细胞内，但有一定的细胞毒性。【关键词】壳聚糖;纳米粒;基因载体;转染　　Abstract:ObjectiveTopreparechitosannanoparticlesasgenevectorssoastoinvestigatetheirstructur

3、alcharacteristicsandcell-genetransfectionefficiencyinvitro.MethodsThechitosan-pDNAnanoparticleswerepreparedby11acomplexcoacervationmethodandtheirmorphologyaswellastheparticlediameterwereobservedundertheelectronicmicroscope.ThebindingofpDNAwasevaluatedbyagarose

4、gelelectrophoresisanalysis;theloadingcapacityandloadingefficiencyweredeterminedwithUV/Visspectrophotometer.Thetransfectionexperimentswereperformedwithhumanembryonickidney293Tcelllineinvitro.Thetransfectionefficiencywasmeasuredunderfluorescentmicroscope.Thecyto

5、toxicitywasobservedwithCellCountingKit-8(CCK-8).ResultsThechitosan-pDNAnanoparticlesweremainlyspherical,withanaveragediameterof(132±48)nm.TheagarosegelelectrophoresisanalysisconfirmedtheDNAwaswhollyencapsulatedinthenanoparticles.Theloadingcapacitywas(48.2±2.0)

6、%andloadingefficiencywas100%.Transfectioninvitroprovedthatchitosan-pDNAwasefficientin293Tcellsandtheexpressionofgreenfluorescentproteinswasobservedunderfluorescentmicroscope.Theinhibitionpercentageofnanoparticleswas(26.08±4.28)%.ConclusionsThechitosan-pDNAnano

7、particlescanbeeffectivelytransfectedintocells.AcertaindegreeofcytotoxicitywasobservedbyCCK8,though.　　Keywords：chitosan;nanoparticles;genevector;11transfection　　基因治疗为近年研究热点，高效低毒的载体为基因治疗的关键[1]。壳聚糖作为一种聚阳离子基因载体，是由葡糖胺和N-乙酰基葡糖胺构成的生物共聚物，有较好的生物相容性和生物可降解性，免疫原性低，毒性小;而且壳

8、聚糖易于和带负电荷的DNA形成纳米级复合物，能有效保护DNA免受核酸酶的降解[2]。目前被认为是很有潜力的基因递送载体[3]。本研究以壳聚糖作为载体，制备壳聚糖-pDNA纳米粒，观察其结构特征，并在细胞水平上测定其转染效果。　　1材料和方法　　1.1材料壳聚糖(分子式：C12H24N2O9,分子质量：340)购自Sigma-Aldrich公司，脂质体Lipo