载基因阳离子脂质超声微泡制备及其体外增强基因转染的实验研究

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1、重庆医科大学硕士学位论文载基因阳离子脂质超声微泡制备及其体外增强基因转染的实验研究姓名：张清凤申请学位级别：硕士专业：影像医学与核医学指导教师：王志刚201205载基因阳离子脂质超声微泡制备及其体外增强基因转染的实验研究摘要第一部分载基因阳离子超声微泡的制备及其特性研究目的制备一种新型的阳离子脂质超声微泡造影剂，评价其载基因能力、理化特性及兔肝体内增强显像效果。方法采用薄膜分散、机械震荡法，经PEG修饰，脂膜材料中加入DC一胆固醇，制备阳离子超声微泡；观察其形态、粒径、表面电位等物理特性，并考察平均粒径、

2、浓度及表面电位在一定条件下随时间(6h、12h、24h、2d、7d、14d)变化情况；Nanodrop2000光度仪测定游离DNA量，分析微泡载基因能力；琼脂糖凝胶电泳检测微泡与DNA复合物能否抵抗核酸酶降解；评价兔肝内显影效果及对人脐静脉内皮细胞(HumanumbilicalveinendothelialceU，HUVEC)的毒性作用；并与普通脂质微泡作对比。结果所制备的阳离子微泡形态规则，稳定性好，马尔文电位仪测本课题由国家自然科学基金面上项目(NO．81071158)，国家自然科学基金青年基金(No

3、_30900370)，国家自然科学基金青年基金(No_30900371)资助；实验平台由重庆医科大学超声影像研究所及超声医学工程省部共建国家重点实验室提供．得平均表面电位为(+29．02土1．30)mV，2周内不同时间点电位变化无统计学差异；2周内平均粒径变化范围为(1201．4士O．47)～(1405．3士0．25nm)，浓度变化范围为(4．13士O．13)～(3．85士O．05)×108／ml。载基因量优化结果显示最大基因结合效率为39．7％，最大基因结合量为4¨∥108个微泡(埘crobubble，

4、MB)。薄膜分散制备方法简单、可靠，且所制阳离子微泡对细胞毒性作用小，与DNA结合后能抗核酸酶降解，兔肝脏内增强显影持续时间超过15111in。结论自制的新型阳离子微泡是一种理想的超声造影剂，能显著增加基因携带量并保护核酸免遭降解，可望提高UMMD增强转染效率，成为基因投递系统的优化材料。关键词：阳离子；超声造影剂；基因第二部分超声联合阳离子超声微泡体外增强基因转染的实验研究目的探索超声破坏阳离子微泡增强基因转染的最佳声学条件，探讨其体外增强基因转染HUVEC效果，与普通脂质微泡及脂质体2000作比较，评

5、价其增强转染同时对细胞活性影响。方法根据细胞存活情况筛选出最佳超声强度和微泡浓度组合；将阳离子微泡、普通脂质微泡、脂质体2000及质粒DNA以不同的处理组加入培养的HUⅦC，分为6组：①单纯质粒组；②质粒+超声辐照组；③质粒+阳离子微泡组；④质粒+普通脂质微泡+超声辐照组；4⑤质粒+脂质体组；⑥质粒+阳离子微泡+超声辐照组；比较各组转染率。同时探讨(质粒+阳离子微泡+超声辐照)组在不同微泡浓度下HUVEC转染率与存活率关系，得出有效转染的微泡浓度；增加HEK293细胞在④⑤⑧三组中与HUVEC转染率比较。

6、应用CKX41荧光显微镜观察绿色荧光蛋白(EGFP)表达，FACS流式仪检测基因转染率，MTT法分析细胞存活率。结果声能为O．5W／cm2，微泡浓度为3>(108／IId时，细胞存活率轻度降低，超声联合阳离子微泡介导基因转染HUVEC效果明显，较普通脂质微泡显著增强，与脂质体2000相比未见明显优势。各处理组对细胞存活率影响无统计学意义，单独考察(质粒+阳离子微泡+超声辐照)组，微泡浓度在(2．5～5．O)×108枷之间时，有较好转染率且细胞损伤程度低，能实现有效的基因转染；HEK293细胞UMMD介导的

7、阳离子微泡转染率高于脂质体2000。结论超声联合阳离子微泡在体外证实能够实现HUVEC较高效率的基因转染，转染率较普通脂质微泡介导的明显提高，寻找最优化的声学条件，在实现高基因转染率时，应防止细胞过多死亡。关键词：超声；阳离子微泡；基因转染重庆医科大学硕士研究生学位论文ULTRASoUNDCoMBINEDWITHCATIoNICMICRoBUBBLELoADINGGENEENHANCEDGENETRANSFECTIONINVITROABSTRACTPARTIEXPERIMENTALSTUDYoNPREPA

8、RATIONANDPRoPERTIESoFCATIoNICLIPIDULTRASoUNDMICRoBUBBLESLoADINGGENEObjectiVeTbpr印areanew够peofselfmadecatiolliclipidul仃asound嘣crobubble．ToassessitsphysicalaJldcheIIlicalpropenies，hi曲geneloadingabili妙anditsenhancement