载HSVTK基因的靶向超声微泡制备及体外寻靶实验

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1、分类号：UDC：R735．7密级重庆医科大学硕士学位论文论文题目载HSV-TK基因的靶向超声微泡制备及体外寻靶实验作者姓名何承峻指导教师姓名(职称、单位名称)刘长安(教授)重庆医科大学附属第二临床学院肝胆外科重庆市渝中区临江路76号申请学位级别硕士学科、专业名称外科学(肝胆外科)论文答辩年月2013年5月J』IIIIIIIIIllIIIIIIIIIIIIfY2412401重庆医科大学研究生学位论文独创性声明本人申明所呈交的论文是我本人在导师指导下进行的研究工作及取得的研究成果。据我所知，除了文中特别加以标注和致谢的地方外，论文中不包含其他人已经发表或撰写过

2、的研究成果，也不包含为获得重庆医科大学或其他教育机构的学位或证书而使用过的材料，与我同工作的同志对本研究所做的任何贡献均已在论文中作了明确的说明并表示谢意。申请学位论文与资料若有不实之处，本人承担一切相关责任。学位论文作者签名：／f自承赂，日期：抄多，≯·，学位论文版权使用授权书本人完全了解重庆医科大学有关保护知识产权的规定，即：研究生在攻读学位期间论文工作的知识产权单位属重庆医科大学。本人保证毕业离校后，发表论文或使用论文工作成果时署名单位为重庆医科大学。学校有权保留并向国家有关部门或机构送交论文的复印件和磁盘，允许论文被查阅和借阅。学校可以公布学位论文

3、的全部或部分内容(保密内容除外)，并编入有关数据库进行检索，可以采用影印、缩印或其他手段保存论文。保密论文在解密后适用本授权书。论文作者签名：／f砀承般指导教师签名：』义日期：文o【；．L}．重庆睦科大学硕士研究生学位论文英汉缩略语名词对照英文缩写英文全称中文全称Bio-DSPEBiotin-distearoylphosphatidyl生物素化磷脂乙醇胺C02C3F8DPPCDMSOD讧FITCGPC3HCCHSv-TKhmlnmVmgmInrnPIRP^Ⅱ．1640ethanolamineCarbondioxide二氧化碳Perfluoropropane

4、全氟丙烷DipalmitoylPhosphatidylcholine二棕榈酰磷脂胆碱DimethylSulfoxide二甲基亚砜Dioctadecyltetmmethylin细胞膜红色荧光探针docarbocyanineperchlorateFluoresceinisothiocyanate异硫氰酸荧光素Glypican一3磷脂酰肌醇蛋白多糖一3Hepatocellularcarcinoma肝细胞型肝癌Herpessimplexvirusthymidine单纯疱疹病毒胸苷激酶kinaseHourMinuteMillivoltMiligramMililite

5、rNanometerPropidiumIodideRoswellParkMemorial一1640小时分钟毫伏毫克毫升纳米碘化丙啶1640培养基载Hsvm基因的靶向超声微泡制备及体外寻靶实验摘要第一部分：靶向脂质超声微泡的制备目的：制备一种脂质超声微泡作为载体，使其粒径为纳米级，并实现其与肝癌细胞特异性抗体的偶联。方法：1．将DPPA、Bio．DSPE按一定摩尔比溶解于有机溶液中，待有机溶液挥发后，形成白色粉末样物质，取出一定量的混合物，加入甘油、PBS缓冲液，45。C水浴后注入C3F8气体采用机械震荡法即可制备出超声微泡。将制备好的超声微泡光镜下观察其形

6、态，粒径仪测定其粒径大小及表面所带zata电位。2．将制备出的超声微泡通过生物素．亲和素系统实现其与抗体的偶联，即在己制备的超声微泡中加入过量的链霉亲和素，再加入生物素化GPC3单克隆抗体即可。加入FITC标记的二抗在激光共聚焦显微镜下观察靶向微泡的形态，流式细胞仪检测标记上抗体的微泡比率。结果：1啼0备出的超声微泡成圆形，大小较均一，平均粒径在528nm左右，所带平均电荷为一22mv。2．靶向超声微泡在免疫荧光显微镜和激光共聚焦显微镜下观察，于蓝光激发波下可见微泡中心为黑色，周围有一圈绿色的荧光，表明GPC3单克隆抗体己经特异性结合于微泡表面，经流式细胞

7、仪检测约85％的超声微泡标记上抗体。本课题授国家自然科学基金面上项目支持(NO：81272570)7重庆医科大学硬士研究生学位论文结论：1．制备出的超声微泡呈圆形、大小较均一，稳定性较好，其粒径为纳米级，满足本次实验要求。2．通过生物素．亲和素系统实现了超声微泡与GPC3单克隆抗体的偶联，为靶向识别及后续研究提供基础。关键词：超声微泡，GPC3，生物素一亲和素，靶向识别第二部分肝癌细胞体外寻靶实验目的：实现连接有GPC3单克隆抗体的超声微泡(即靶向超声微泡)与人肝癌H印G2细胞特异性结合。方法：1．分别培养人肝癌HepG2细胞株、人肝脏L02细胞株，细胞免

8、疫组化实验，检测证实肝细胞型肝癌(HCC)细胞膜表面有特异性GPC