葡聚糖精胺阳离子聚合物基因载体体外基因转染的研究

《葡聚糖精胺阳离子聚合物基因载体体外基因转染的研究》由会员上传分享，免费在线阅读，更多相关内容在学术论文-天天文库。

1、南方医科大学硕士学位论文葡聚糖-精胺阳离子聚合物基因载体体外基因转染的研究姓名：平渊申请学位级别：硕士专业：药剂学指导教师：陈建海20070410硕士学位论文葡聚糖一精胺阳离子聚合物基因载体体外基因转染的研究硕士研究生：平渊指导教师：陈建海摘要背景：基因治疗是通过插入治疗基因至病交细胞内而产生特定功能的蛋白质或抑制异常基因表达，从而治疗疾病的一种新方法。基因治疗中首要难题是缺乏高效、安全及靶向的基因导入系统，即能将治疗基因输送至特定的靶细胞内并高效表达的、无毒或低毒的基因载体。目前基因载体的主要分为两类：病毒载体或非病毒载体。虽然

2、非病毒载体在体内外基因转染效率低于病毒载体，且基因表达时间短，但其具有低免疫原性、能携带大分子量DNA及生物安全性高等特点而倍受青睐。阳离子聚合物是非病毒载体中最有潜力的一类载体系统，它们可通过结构修饰改变其物理化学及生物学性质。目的：合成水溶性葡聚糖．精胺阳离子聚合物基因载体DSP，研究以DSP为粘合剂基因枪子弹的制备方法、DSP／DNA复合物和基因枪子弹的生物物理学性质、初步探讨复合物的理化性质对其转染能力的影响。方法：研究以平均分子量为40KDa的葡聚糖作为反应起始物，在室温下经高碘酸钾氧化6个小时，得到了氧化葡聚糖。通过盐

3、酸羟胺法测定了氧化葡聚糖醛基的含量，根据此含量将一定摩尔比的精胺与氧化葡聚糖反应，该反应能中文摘要生成含希夫氏碱的葡聚糖．精胺亚胺聚合物，所得到的亚胺聚合物在过量硼氢化钠作用下，可还原生成稳定葡聚糖一精胺共价阳离子聚合物(DSP)。DSP的总含氮量及伯胺的含量分别通过元素分析仪及TNBS法测定，并计算了所合成DSP的接枝度及支化度；FT-IR及1H-NMR鉴定了DSP化学结构。采用激光粒度仪测定复合物溶液的粒径和Zeta电位；琼脂糖凝胶电泳法考察DSP与DNA的结合能力，及DSP对DNA在核酸酶I作用下的保护能力；滴定法考察DSP

4、的在酸性条件下的缓冲能力；复合物体外转染SMMC一7721肝癌细胞及BHK-21细胞，通过荧光倒置倒置显微镜观察复合物对两株细胞的转染情况并计算转染率；MTI"法考察复合物细胞毒性。在此基础上，研究了以DSP为粘合剂制备的基因枪子弹．并通过琼脂糖凝胶电泳、核酸酶降解试验和MTT法，分别研究了子弹的稳定性，抗核酸酶I能力及细胞毒性。结果：所合成氧化葡聚糖醛基含量为8．474-O．15mmoVg，DSP接枝度为38．9％，支化度为38．5％。DSP能通过其带正电荷的氨基基团能与DNA带负电荷的磷酸基团通过静电吸附而将DNA完全压缩并中

5、和其负电荷，使DNA缩合形成复合物。复合物质量比(DSP／DNA)在4：1至20：i之间，能形成稳定的复合物；复合物粒径范围为162．6．187．9rim，Zeta电位则从+8．45mV增至+39．6mV；DSP能充分压缩DNA并与之紧密吸附；DSP能有效保护DNA不受核酸酶I降解，同时在一定pH范围内载体具有较强的缓冲能力；复合物在质量比为8：1时(此时粒径为170．8-+-23．9rim，Zeta电位为+18．3士1．55mV)，对SMMC-7721肝癌细胞、BHK-21细胞的转染率均达到最高，分别为27．O4-4．42％及2

6、2．24-4．63％，其效果均与Lipofeoamine2000相当；复合物的毒性随质粒浓度及DSP／DNA质量比增加：所制备的基因枪子弹溶液在不同DSP／DNA．及DNA／金比例下均能粘合且能保护质粒不受核酸酶降解；金含量越高，DSP／DNA比例越大，细胞毒性则越大。n硕士学位论文结论：该研究表明DSP／DNA复合物的粒径、电位、稳定性、抗核酸酶能力、缓冲容量及细胞毒性对其转染能力具有一定影响。所合成的葡聚糖-精胺阳离子聚合物是一种制备工艺简单、高效、低毒的基因载体，有望今后用于临床基因治疗。以DSP制备的基因枪子弹抗核酸酶能力

7、强，有望提高体内基因枪转染效率。关键词：葡聚糖．精胺阳离子聚合物；转染率；复合物；基因枪子弹IN硕士学位论文Dextran—sperminepolycationasavectorforgenetransfectioninName：PingYuanSupervisor：ChenJianhaiABSTRACTBackground：Genetherapyis她approachforhumandiseaseIxeatmentbyinsertingtherapeuticgeneintocellsinordertoproducedesired

8、proteinswithspecificfunctionsandtOinhibitexpressionofabnormalgenes．Theprincipleproblemencounteredingenetherapyislackofeffici