阳离子聚合物βcdpamam作为基因载体的评估

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1、中山大学硕士学位论文阳离子聚合物β-CD-PAMAM作为基因载体的评估姓名：李娜申请学位级别：硕士专业：内科学指导教师：严励20100602中山大学硕士学位论文阳离子聚合物B—CD-P肼枷作为基因载体的评估阳离子聚合物13-CD．PAMAM作为基因载体的评估专业：内科学学位申请人：李娜导师：严励教授中文摘要糖尿病患者皮肤易损，且一旦出现伤口很难愈合。其原因主要包括：(1)患者全身因素(如代谢营养状况、免疫力等)；(2)伤口局部因素(如是否合并感染、周围组织的血管病变、神经病变等)；(3)伤口微观的改变(Et量的基质金属蛋

2、白酶分泌、生长因子缺乏、组织增殖能力降低、微循环的异常、炎症因子分泌过多等)。这些原因最终导致细胞外基质合成和降解的失平衡，从而影响溃疡愈合。基质金属蛋白酶9(脚．9)是基质金属蛋白酶(M^伸s)家族中的一员，又称明胶酶B，是依赖Zn2+的金属酶。在糖尿病病理状态下：(1)研究发现糖尿病病人的足溃疡渗出液中基质金属蛋白酶9(舢．9)的水平较正常人升高。(2)本课题组前期研究发现糖尿病大鼠皮肤MMP．9的水平较正常大鼠明显增高，MMP．9／TIMP．1(组织金属蛋白酶抑制剂．1)之间平衡失调，细胞外基质过度降解，可能与糖尿

3、病大鼠伤口愈合减慢有关。(3)在糖尿病足患者中，单纯局部应用生长因子并不能加快溃疡愈合，考虑可能与MMP．9的升高加速降解生长因子、生长因子受体、整合素及其受体，从而加重伤口局部炎症反应，减慢伤口愈合。因此抑制伤口局部MMP．9的表达是促进糖尿病足伤口愈合的可选择方法之一。然而目前还没有特异性MMP．9抑制剂，且1V11VIPs抑制剂(TIMP)价格十分昂贵，不适合临床常规使用，所以，通过RNA干扰技术抑制糖尿病伤口MMP．9的表达成为可供选择的方法之一。RNA干扰(RNAinterference,RNAi)近年来发展迅

4、速，已经从基础研究发展中山大学硕士学位论文阳离子聚合物B-CD-PAM枷作为基因载体的评估到临床应用。RNA干扰技术的核心是通过内源性或外源性双链RNA(dsRNA)介导的细胞内mRNA发生特异性降解，导致靶基因的表达沉默，产生相应的功能表型缺失，这种依赖于dsRNA的转录后基因沉默过程被称为RNA干扰。此技术的关键步骤之一就是将基因转导进入细胞的技术。基因的转导需要高效率、高安全性的载体，由于病毒载体潜在的安全性问题，很大程度限制了其在体内实验中的应用，故人们一直致力寻找新的基因转导载体。非病毒载体中的新型阳离子聚合物

5、目前受到极大关注，因为其具有以下优点：(1)无免疫原性，不会引起机体的免疫反应；(2)通过控制粒径尺寸和表面性质可控制载体的生理行为；(3)可根据需要设计载体的分子结构；(4)遗传物质的释放可做到由聚合物基质的降解速率决定。阳离子聚合物与核酸带负电的磷酸基团通过静电相互作用形成复合物后与细胞表面带负电的蛋白多糖相互作用，并通过内吞作用进入细胞。中山大学化学与化学工程学院高分子研究所张黎明教授课题组通过分子设计合成星型阳离子聚合物争CD．PAMAM，该聚合物具有以下优点：(1)具有良好的水溶性和生物相容性；(2)可与stR

6、NA形成纳米粒；(3)表面大量的阳离子基团，提供了进一步功能化的可能。但该聚合物生物安全性、对siRNA的结合和转导能力如何还不明确。pCD．PAMAM的化学结构如下：Ⅱ中山大学硕士学位论文阳离子聚合物13-O)-PAIO山!作为基因载体的评估研究目的1．了解肛cD．PAMAM的细胞毒性。2．探讨阻CD．PAMAM与MMP．9特异性siRNA的结合能力。3．pCD．PAMAM介导FAM标记的siRNA转染效率评估。4．肛CD．PAMAM介导的RNAi对大鼠皮肤成纤维细胞CRLl213MMP．9抑制效果评估。材料与方法所用

7、细胞为大鼠皮肤成纤维细胞株CRLl213(编号4032860)，购自美国组织培养库(ATCC)。1．争CD．PAMAlVI的细胞毒性实验(MTT法)将大鼠皮肤成纤维细胞株CRLl213分为正糖培养组(5．6nmaol／L)和高糖培养组(25retool／L)，每种糖浓度组再根据13-CD．PAMAM的终浓度分为21．3ug／ml、16．0ug／mt、10．7ug／ml、5．3ug／ml、2．1ug／ml及空白对照组，每组设五个复孔，加入13-CD-PAMAM后24h、48h、72h测各组在492nm的OD值。细胞活力(％

8、)=【A492(实验组)／A492(对照组)】×100，实验重复三次结果取平均值。2．琼脂糖凝胶电泳检测新型阳离子聚合物争CnPAM』蝴与siRNA结合能力pCD．PAMAM与MMP一9特异性siRNA按照质量L北40：l、30：1、20：1、10：1、4：1混合后行琼脂糖凝胶电泳，带正电荷的聚合物与带负电的siRN