庆大霉素单克隆抗体的制备及elisa检测方法研究

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1、庆大霉素单克隆抗体的制备及ELISA检测方法研究【摘要】目的对庆大霉素单克隆抗体的制备以及检测进行研究；方法本研究采用碳二亚胺法将庆大霉素与载体蛋白偶联形成完全抗原，用基质辅助激光解吸／电离质谱进行了表征，以人工抗原免疫BALB／C小鼠；结果通过杂交瘤技术获得了分泌抗庆大霉素单克隆抗体并能稳定传代的杂交瘤细胞株，建立了庆大霉素间接竞争ELISA检测方法，其线性检测范围为0．1～5ng／mL，半数抑制浓度(1C50)为0．8ng／mL，与其他化合物的交叉反应率小于0．01％。【关键词】庆大霉素制备检测庆大霉素是由小单胞菌产生的一种氨基糖苷类抗生素，对多种革兰阳性和阴性菌都具有显著的抗菌效果，

2、作为饲料添加剂和治疗疾病的抗生素广泛应用于畜牧业。然而，庆大霉素对人类具有明显的毒害作用，对脑神经、听觉以及肾脏的损害严重。庆大霉素残留的ELISA检测国外已有报道，但是利用ELISA法研究其在牛奶中的残留规律，国内外尚未见报道。本文合成了庆大霉素的免疫原和包被原，制备了单克隆抗体，采用MALDI—TOFMS对蛋白偶联抗原进行了表征，建立了检测庆大霉素的酶联免疫检测法，并成功地用于牛奶中庆大霉素的实际检测。1材料与方法1．1试剂：庆大霉素硫酸盐、血蓝蛋白丁二酸酯(sKLH)、牛血清白蛋白(BSA)、碳化二亚胺盐酸盐(EDC?HCI)、弗氏完全佐剂、弗氏不完全佐剂、HRP标记羊抗鼠IgG：

3、SIGMA；PEG1500：Gibco。1．2实验动物BALB／C小鼠，购于济南生物制品所。1．3庆大霉素全抗原的合成鉴定1.3．1免疫原的合成：取40mg庆大霉素硫酸盐和12mgsKLH溶于1．5mLPBS，在磁力搅拌器中进行均匀地搅拌。取280mgEDC?HCl溶于lmLPBS中，调pH至7．5，再慢慢地滴加到上述混合溶液中，并且在室温下搅拌1h左右，然后于5℃放置2d。用PBS透析3d后，分装，—20℃贮存。1．3．2完全抗原的鉴定：利用MALDI—TOFMS测定BSA及genta—BSA分子量，并根据分子量计算偶联比率。1．4单克隆抗体制备1．4．1免疫方法：首免采用CAP

4、—BSA与等量福氏完全佐剂注射器互推法乳化完全后腹腔注射，剂量为100μg／只。2周后，换用福氏不完全佐剂二免，以后每隔14天强免1次。三免后8d，小鼠断尾采血，用间接ELISA方法检测血清效价，直至血清效价达到1：8000以上。融合前2d，不加佐剂尾静脉注射强免1次，按常规方法融合免疫脾细胞和SP2／0骨髓瘤细胞。1．4．2细胞融合取小鼠脾细胞与Sp2／0骨髓瘤细胞在PEGl500作用下融合。将融合后的细胞悬液加入含饲养细胞的96孔细胞培养板中，以HAT培养基选择培养。1．4．3阳性杂交瘤细胞筛选及克隆化：融合细胞于第10天用HT培养液半量换液；用间接ELlSA和阻断ELISA进行阳性孔

5、筛选，选择强阳性、抑制率高、细胞生长旺盛的孔进行有限稀释克隆化，而后扩大培养、冻存、鉴定和建株。1．4．4单克隆抗体制备：用高压灭菌(115℃)的石蜡油注入到雌性BALB／c小鼠(5—7周龄)腹腔内，0.5ml／只。8—11d后，每只小鼠腹腔注射2×105个杂交瘤细胞，当小鼠腹部胀大时收集腹水，间接ELISA方法测定效价并及时冻存。再7d后取小鼠腹水，用ProtEinG柱纯化，获得抗庆大霉素单克隆抗体IgG。1．5抗体特效的测定用于抗体交叉反应性研究的竞争物为卡那霉素、新霉素、链霉素、氯霉素、头孢氨苄、磺胺二甲氧嘧啶、恩诺沙星。利用Marker中标准蛋白在凝胶中的相对迁移率与相对分子质量的关

6、系做标准曲线，SPSS进行曲线拟合并求回归方程。将4B12的重链和轻链在凝胶中的相对迁移率代人回归方程，再根据IgG中重链和轻链的比例关，系计算其相对分子质量。1．6牛奶检测应用：取5头患乳房炎奶牛，1．8mg／kg体重肌肉注射庆大霉素注射液进行治疗，早晚各注射1次，连续给药3d。停药后分别于第7、14、24、35、50、62、75、85、100h采集牛奶样品，5头牛共50份样本，4℃，2000r／min离心10min，去除上层脂肪，用PBS缓冲液将样品做10倍稀释，取50uL用竞争性ELISA法进行检测。2结果3讨论庆大霉素是小分子物质，不具备免疫原性，因此需

7、要载体蛋白与其偶联才可形成完全抗原。本研究采用碳二亚胺法将庆大霉素的氨基与载体蛋白的羧基交联制备免疫抗原和包被抗原。碳二亚胺是一类很强的脱水剂，能使庆大霉素上的羧基与载体蛋白上酌氨基形成酰胺键，但这种缩合反应没有选择性，易形成蛋白分子间的自身聚合，产生非均一性产物，严重影响了偶联的效率，为了减少蛋白的自身反应，本试验采用封闭羧基的血蓝蛋白丁二酸酯作为载体蛋白，能有效减少蛋白之间聚合。单克隆抗体的制