抗人β2微球蛋白单克隆抗体的制备及elisa检测方法的初步建立

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1、Athesis(dissertation)submittedtoZhengzhouuniVers时forthedegreeofMasterPreparationofMonoclonalAntibodiesagainstp2一microglobulinandInitiallyEstablishedELISADetectionMethodByLieMaoSupervisor：ProfY．unlongⅥ，aJlgBiochemis仃yaJldMolecul舶iologyCollegeoflifesciencesMay，2014学位论文原创性声明本人郑重

2、声明：所呈交的学位论文，是本人在导师的指导下，独立进行研究所取得的成果。除文中已经注明引用的内容外，本论文不包含任何其他个人或集体己经发表或撰写过的科研成果。对本文的研究作出重要贡献的个人和集体，均己在文中以明确方式标明。本声明的法律责任由本人承担。学位论文作者：日期：y／p年6月70日学位论文使用授权声明本人在导师指导下完成的论文及相关的职务作品，知识产权归属郑州大学。根据郑州大学有关保留、使用学位论文的规定，同意学校保留或向国家有关部门或机构送交论文的复印件和电子版，允许论文被查阅和借阅；本人授权郑州大学可以将本学位论文的全部或部分编入有关数

3、据库进行检索，可以采用影印、缩印或者其他复制手段保存论文和汇编本学位论文。本人离校后发表、使用学位论文或与该学位论文直接相关的学术论文或成果时，第一署名单位仍然为郑州大学。保密论文在解密后应遵守此规定。学位论文作者：日期：、局I￥年6月f总日摘要p2微球蛋白(p2．microglobulin，B2一MG)是由机体产生的一种内源性低分子量血清蛋白质，分子量1l。8l①，是细胞膜上完整主要组织相容性复合物(major11istocoInpatibili西complex，MHC)I类分子的轻链(p链)，在免疫应答中起重要作用。随着代谢和MHc的降解，B

4、2微球蛋白分离后以游离形式存在于血清、尿液、脑脊液、唾液等体液中，含量较低且恒定。近年来，B2微球蛋白在基础医学及临床诊断上的应用己成为研究热点，检测血清或尿液中p2微球蛋白含量的变化成为评价相关脏器功能和某些疾病发生、发展和预后的重要指标。胆微球蛋白的检测方法主要有免疫比浊法、免疫透射比浊法、化学发光法等，其中酶联免疫法因简便、快速、敏感性高而备受临床欢迎，而目前可应用于临床的ELIsA试剂盒较少，因此研制一种快捷有效的ELIsA检测方法具有重要意义。本研究以高纯度的人B2微球蛋白作为免疫原，采用常规免疫和脾内免疫相结合的方法免疫纯系BALB／

5、c小鼠，取免疫脾细胞与对数期SP2／O细胞进行融合，间接ELIsA法筛选阳性孔。经3~4次克隆化、多次传代及冻存后复苏，共筛选获得5株稳定分泌抗人p2微球蛋白的单克隆抗体杂交瘤细胞株，分别命名为2G7、2H2、3F9、5D10、8E12。经鉴定，5株单抗亚型皆为IgGl类，腹水效价均在10刁一1o-9之间，腹水经Protein_A亲和层析法纯化后进行电泳，结果显示5株单抗纯度良好。间接ELIsA法和westemblot鉴定单抗特异性，结果表明5株单抗均能与人B2微球蛋白发生特异结合，而与人血清白蛋白、血红蛋白、EB病毒基因工程抗原、支原体基因工程

6、抗原无交叉反应，证明5株单抗具有良好的特异性和反应原性。采用改良过碘酸钠法分别对5株单抗进行酶标，经抗体配对实验筛选出一对可用于双抗体夹心ELISA的配对抗体，初步建立了B2微球蛋白双抗体夹心定量ELIsA检测方法。经方阵滴定实验确定了包被抗体最佳包被浓度为3ug／InL，酶标二抗最佳工作浓度为1：4000，该检测方法线性范围为1．25～40ngAnL，最低检出限为1．25n咖L，批内CV<8％，批间CV<12％，准确度良好。用本研究建立的检测方法检测35份临床血清标本B2微球蛋白含量，与Roche公司的p2微球蛋白检测试剂盒检测结果相比，相关系

7、数R2=O．9550，两者具有良好的相关摘要性。本研究成功制备了抗人p2微球蛋白单克隆抗体杂交瘤细胞株，初步建立了人B2微球蛋白双抗体夹心定量ELISA检测方法，为进一步研制快速诊断试剂盒和其他检测方法奠定了良好的基础。关键词：B2微球蛋白；单克隆抗体；双抗体夹心ELIsAAbstractB2一microglobulin(D2-micr0910buliIl，p2-MG)isa11endogenousproteinwitlllowmolecular、veightof11．8KDintheserum．It’s血elightchain(p·chain)

8、ofc1嬲sIinmembraneintegri锣ofm萄orhistocompatibilit)，complex(MHC)，andpl